[发明专利]一种仿生矿化固定化酶和辅因子的制备方法及仿生矿化固定化酶和辅因子

说明书

本发明提供了一种仿生矿化固定化酶和辅因子的制备方法及仿生矿化固定化酶和辅因子，包括下列步骤：将酶液溶于磷酸盐缓冲溶液中，所述酶液中的目的酶带有组氨酸标签，将金属盐和辅因子加入酶液中，得到溶液A，其中所述金属盐中的金属离子可与所述磷酸根离子形成矿物，所述辅因子带有负电荷；将所述溶液A混合均匀后在室温下静置，得到沉淀B；将含有所述沉淀B的溶液A进行离心、洗涤，得到仿生矿化固定化酶及辅因子。本发明采用仿生矿化法同时将酶和辅因子固定在同一载体上，所得固定化酶和辅因子粒子形貌规则，粒径约为9～50μm且存在介孔结构；固定化酶和辅因子对高温、pH有很好的耐受性，重复使用和贮藏稳定性高，且该固定化解决了辅因子难以回收再利用的难题。

技术领域

本发明涉及固定化酶领域，特别涉及一种仿生矿化固定化酶和辅因子的制备方法及仿生矿化固定化酶和辅因子。

背景技术

酶作为生物催化剂，具备反应条件温和、来源广泛、无污染、催化效率高、催化专一等优点而受到了人们青睐。但是游离酶稳定性差、难回收利用、易失活的缺点，不仅限制了其广泛应用而且增加了应用成本。为了解决这项难题，克服游离酶难以分离回收等缺点，固定化酶的理念应运而生，酶被固定化后经简单的离心等操作即可分离出来，可实现多次重复使用；它还可提高酶的pH稳定性和热稳定性，避免某些操作步骤对酶活造成影响；相对于游离酶来讲，固定化酶的储藏稳定性也大大提高。总之，固定化酶的出现使生物酶在工业上的自动化生产和连续控制成为可能，同时在理论方面也为酶促反应机理及动力学的研究提供了良好的模型。

辅因子在辅因子依赖型酶的生物催化中发挥重要的作用，因此近年来出现了越来越多的关于辅因子方面的研究。但是辅因子价格昂贵，难以扩大应用，辅因子的原位再生及固定化循环使用成为解决此问题的关键。其中，酶和辅因子同时固定化在同一个载体上，可以实现固定化辅因子的回收利用和固定化酶的高效催化，从而提高了酶的广泛工业应用可能性。因此，对酶和辅因子固定化从而达到可回收的目的，值得进一步研究。

在国内外的研究中，将酶和辅因子固定化在同一个载体上是化学领域的难题。SusanaVelasco-Lozano等人将酶和聚醚酰亚胺不可逆地结合到固体表面，随后辅因子通过离子交换作用可逆地吸附到聚醚酰亚胺上，通过这种技术获得的固定化酶和辅因子生物催化剂实现了辅因子的回收利用，具备较高的酶反应催化活性。GiuseppeRulli等人将乙醇脱氢酶和辅因子共同固定在超强吸水剂上，所得固定化酶展现了较高的催化性能，且重复使用性好。Leandro H等将含有高表达ω-转氨酶的大肠杆菌细胞和PLP成功地固定于大孔的甲基丙烯酸酯珠中，使用有机溶剂抑制PLP的泄露，生物催化剂固定化细胞及辅因子应用于填充床反应器中，该系统具备高通量，清洁生产，高稳定性的特点，构建了一种新的固定化方法。Ji等将辅因子和酶封装在阳离子聚电解质掺杂的中空纳米纤维内腔，实现了辅因子的再生，并发现固定化酶系统具有较高的催化活性和重复使用稳定性。

以上固定化酶及辅因子技术，虽然能得到不同类型的生物催化剂，但是固定化酶的酶活性损失较快，且辅因子难以回收再利用。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种仿生矿化固定化酶和辅因子的制备方法，以制得仿生矿化固定化酶及辅因子。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种仿生矿化固定化酶和辅因子的制备方法，包括下列步骤：

S1：将酶液溶于磷酸盐缓冲溶液中，所述酶液中的目的酶带有组氨酸标签，将金属盐和辅因子加入酶液中，得到溶液A；所述金属盐中的金属离子可与磷酸根离子形成矿物；所述辅因子带有负电荷；

S2：将所述溶液A混合均匀后在常温下静置，生成沉淀B；

S3：将含有所述沉淀B的溶液A进行离心、洗涤，得到仿生矿化固定化酶及辅因子。

进一步的，所述磷酸盐缓冲溶液为中性或弱碱性。