[发明专利]一种高效发酵生产重组细菌漆酶的方法

说明书

本发明公开了一种高效发酵生产重组细菌漆酶的方法。该方法是在重组大肠杆菌发酵过程中加入甲醇、乙醇、曲拉通、甘氨酸、甜菜碱，甘油，山梨醇中的任意一种或多种胁迫剂而达到的。本发明利用胁迫剂的胁迫作用，延缓菌体的生长，减少乙酸的堆积造成的毒害作用，重组细菌漆酶的表达量得到明显提高。使用本发明提供的方法，利用重组大肠杆菌进行重组细菌漆酶的发酵生产，在总酶活(总重组蛋白产量)、胞内酶活(胞内重组蛋白产量)、胞外酶活(胞外重组蛋白产量)三方面均高于目前已报道的最高的重组细菌漆酶产量(重组蛋白产量)。

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及到一种提高重组大肠杆菌发酵生产重组细 菌漆酶产量的方法。

背景技术

漆酶(laccase，苯二醇：氧氧化还原酶，EC1.10.3.2)是一种含铜的 多酚氧化酶，与植物中的抗坏血酸氧化酶(ascorbieacidoxidase)、哺乳动物的 血浆铜蓝蛋白(ceruloplasmin)同源，属于蓝铜氧化酶(bluecopperoxidase)家 族中的一员，它能利用分子氧作为电子受体氧化多种类型的酚类化合物(例如阿 魏酸)及非酚类的化合物，催化反应的唯一副产物为水，被誉为最绿色、环保的 生物催化剂。漆酶在环境污染物的的治理、食品加工业、制浆和造纸工业、纺织 工业、土壤的生物修复和纳米生物技术等领域具有广泛的应用，如去除含酚的污 染物、染料脱色、有机物合成，废水脱色，饮料的澄清与色泽控制，食用菌、药 用菌的生产，食物成份功能性的改进以及植物食品保护等。根据来源的不同，漆酶可分为真菌漆酶和细菌漆酶。

真菌漆酶一般具有较高的酶活,发酵产量为50000-100000U/L,但真菌漆酶 pH适应范围较窄，pH大于7的条件迅速失活；同时真菌漆酶热稳定性较差，最 适温度一般在30℃到45℃之间50℃以上的高温也会迅速失去活性。因此，真菌 漆酶虽然发酵产量较高，但是其pH适应性和热稳定性的原因，限制了其应用的 范围。细菌漆酶具有良好的热稳定性、酶反应pH值范围广、对卤素稳定性好等 特点。同时，与真菌发酵漆酶相比，细菌培养周期短，所需营养成分简单，具有 发酵能耗低的优势。然而目前细菌漆酶发酵产量低，很难达到工业发酵水平的要 求。

由于很难获得理想高产漆酶的细菌，因此利用重组技术，克隆漆酶基因并转 化入大肠杆菌或枯草杆菌等细菌宿主菌，构建重组基因工程菌，通过控制发酵条 件，提高细菌漆酶的发酵水平，是解决细菌漆酶产量低的问题的策略。目前，已 有提高大肠杆菌发酵细菌漆酶的研究，如漆酶基因密码子优化、选择合适的启动 子、提高mRNA稳定性、利用融合蛋白与分子伴侣、通过删除工程菌副产物合成 途径、调控发酵条件实现高密度培养等方法，虽然在一定程度上提高了重组细 菌漆酶的发酵产量，但与真菌漆酶发酵水平相比，仍存在很大的差距，目前报道 的利用大肠杆菌发酵生产重组细菌漆酶的最高产量为4000-6000U/L。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述，提供一种利用重组大肠杆菌高效发酵 生产重组细菌漆酶的方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种高效生产重组细菌漆酶的方法，在产细菌漆酶的重组大肠杆菌发酵过程 中添加甲醇、乙醇、曲拉通、甘氨酸、甜菜碱、吐温、司盘、甘油、山梨醇中的 任意一种或多种胁迫剂对漆酶进行诱导表达。

本发明所述的方法，优选在产细菌漆酶的重组大肠杆菌发酵的0-2h加入 1-10％(v/v)的甲醇、曲拉通或甲醇和曲拉通的组合。

本发明所述的方法，甲醇的添加时间优选0-0.5h,进一步优选0h，添加量 优选4-8％，进一步优选6％。

本发明所述的方法，曲拉通的添加时间优选0-0.5h,进一步优选0h，添加 量优选2-5％，进一步优选添加量为4％。

本发明所述的方法，甲醇和曲拉通复合诱导剂的添加时间为0-0.5h,添加量 为甲醇4-8％，曲拉通2-5％；且两者总和不超过10％。