[发明专利]特异性诱导肿瘤细胞凋亡的重组人Fc抗体及其制备方法、用途

权利要求书

1.一种特异性诱导肿瘤细胞凋亡的重组人Fc融合蛋白，其特征是：

(1)通过人工合成的方法直接获得重组人Fc抗体基因片段，其完整核酸序列为SEQ IDNo: 1，SEQ ID No: 1序列由下列三个基因片段构成：人IgG H链Fc片段的基因片段、序列为SEQ ID No: 2；链接片段基因、序列为SEQ ID No: 3；VP3基因片段、序列为SQE ID No: 4；

(2) 此重组人Fc抗体的完整氨基酸序列为序列SEQ ID No: 5，该序列由下列3个氨基酸片段构成：IgG H链Fc片段的氨基酸片段、序列为SEQ ID No: 6；链接片段氨基酸、序列为SEQ ID No: 7；VP3氨基酸片段、序列为SQE ID No: 8。

2.按照权利要求1所述的特异性诱导肿瘤细胞凋亡的重组人Fc融合蛋白，其特征是：所述重组人Fc抗体基因片段亚克隆到酵母表达载体及在酵母细胞中表达；或亚克隆到哺乳细胞表达载体及在哺乳细胞中表达。

3.制备权利要求2所述的特异性诱导肿瘤细胞凋亡的重组人Fc融合蛋白的方法，其特征是：

(1) 重组人Fc抗体酵母工程菌的构建、发酵及回收，将人工合成的基因片段“Fc-linker-VP3”亚克隆到酵母表达载体pPIC9K载体，转化毕赤酵母系统GS115菌株，筛选高效表达细胞株，表达重组人Fc抗体蛋白；

(2) 重组人Fc抗体蛋白的纯化 取发酵培养上清缓慢加入等体积的饱和硫酸铵，混匀后4℃放置4小时以上，4℃下5000g离心20min 收集沉淀，沉淀用100ml平衡液溶解，并对平衡液2000平衡液透析12小时以上，中间换夜一次；样品再上用平衡液平衡好的阴离子层析柱或-20℃ 保存备用，分别用含0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L和1mol/LNaCl的平衡液洗脱，收集洗脱峰，SDS电泳鉴定，取含分子量39kD蛋白质部分；用平衡液平衡Separose12层析柱；将上述浓缩的39kD蛋白质部分按床体积的3%比例上样，流速为2ml/min；分步收集；SDS电泳鉴定后，收集分子量为39kD纯度高的蛋白质部分即为重组人Fc抗体；

(3) 纯化的重组人Fc抗体鉴定 采用SDS电泳法或高效液相法测定蛋白质纯度，纯度在95%以上,分子量为39kD，采用紫外分光光度计测定蛋白质含量，为0.5mg/ml。

4.制备权利要求2所述的特异性诱导肿瘤细胞凋亡的重组人Fc融合蛋白的方法，其特征是：

（1）重组人Fc抗体哺乳细胞株的构建、发酵及回收，将人工合成的基因片段“Fc-linker-VP3”亚克隆到哺乳细胞表达载体pATX2载体，脂质体法转染哺乳细胞CHO细胞株表达，筛选高效表达细胞株，表达重组人Fc抗体蛋白；

（2）重组人Fc抗体蛋白的纯化 取CHO细胞培养上清，缓慢加入等体积的饱和硫酸铵，混匀后4℃放置4小时以上，4℃下5000g离心20min 收集沉淀，沉淀用100ml平衡液溶解，并对平衡液2000平衡液透析12小时以上，中间换夜一次；样品再上用平衡液平衡好的阴离子层析柱或-20℃ 保存备用，分别用含0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L和1mol/LNaCl的平衡液洗脱，收集洗脱峰，SDS电泳鉴定，取含分子量39kD蛋白质部分；用平衡液平衡Separose12层析柱；将上述浓缩的39kD蛋白质部分按床体积的3%比例上样，流速为2ml/min；分步收集；SDS电泳鉴定后，收集分子量为39kD纯度高的蛋白质部分即为重组人Fc抗体；

(3) 纯化的重组人Fc抗体鉴定 采用SDS电泳法或高效液相法测定蛋白质纯度，纯度在96%以上,分子量为39kD，采用紫外分光光度计测定蛋白质含量，为0.5mg/ml。

5.权利要求1或2所述的一种特异性诱导肿瘤细胞凋亡的重组人Fc融合蛋白在制备用于抗恶性肿瘤治疗的药物中的用途。