[发明专利]一种检测呕吐毒素及其乙酰化衍生物的时间分辨荧光免疫层析卡

权利要求书

1.一种检测呕吐毒素及其乙酰化衍生物的时间分辨荧光免疫层析卡，其特征在于所述层析卡包括由样品垫（1）、标记垫（2）、硝酸纤维素NC膜（3）、吸水滤纸（4）和PVC底板（5）组成；所述标记垫（2）上固定有纳米铕荧光微球标记的呕吐毒素单克隆抗体1和抗体2；所述抗体1对呕吐毒素DON和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇15-Ac-DON表现出高度的特异性；所述抗体2对呕吐毒素DON和3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇3-Ac-DON表现出高度的特异性；所述NC膜上喷涂有测试线T线（6）和控制线C线（7），T线固定有呕吐毒素-牛血清白蛋白DON-BSA包被抗原，C线固定有羊抗鼠抗体IgG。

2.权利要求1所述检测呕吐毒素及其乙酰化衍生物的时间分辨荧光免疫层析卡的制备方法，其特征在于步骤为：

（1）样品垫的制备：用含牛血清白蛋白BSA、吐温-20的磷酸缓冲液，浸泡玻璃纤维或聚酯纤维材料垫，然后置于温箱中烘干，获得样品垫；

（2）标记垫的制备：用含牛血清白蛋白BSA、吐温-20的磷酸缓冲液，浸泡玻璃纤维或聚酯纤维材料垫，然后置于温箱中烘干；将纳米铕荧光微球标记的呕吐毒素单克隆抗体1和抗体2，分别用含有海藻糖、蔗糖、BSA、吐温-20的磷酸缓冲液稀释，然后用喷金仪喷涂于该烘干后的材料垫上，置于温箱中烘干，获得标记垫；

（3）NC膜的制备：用含蔗糖的磷酸缓冲液，溶解包被抗原DON-BSA，使得浓度为0.4～0.8mg/mL；然后采用自动喷膜仪喷涂在NC膜上，喷量为0.5～3 μL/cm，得到T线；用相同的磷酸缓冲液，溶解羊抗鼠IgG，使得浓度为0.8～1.2 mg/mL；然后采用自动喷膜仪喷涂在距离T线右侧3～5 mm位置处，喷量为0.5～3 μL/cm，得到C线；在温箱内烘干，获得NC膜；

（4）层析卡的组装：以PVC 底板为衬板，将制备好的样品垫、标记垫、NC膜与吸水滤纸，由左端依次粘贴在底板上，并且相互之间有1～3 mm的交联，然后用切割机切割成一定尺寸的长条，装于塑料卡壳中，用压壳机压紧。

3.根据权利要求2所述检测呕吐毒素及其乙酰化衍生物的时间分辨荧光免疫层析卡的制备方法，其特征在于步骤（2）中使用的纳米铕荧光微球为表面带有羧基的聚苯乙烯荧光微球，是通过以下步骤获得的：首先采用β-二酮类螯合剂BHHCT 4,4′-二(1″,1″,1″,2″,2″,3″,3″-七氟-4″,6″-己二酮-6″-酰基) -氯磺化邻三联苯与烯丙基胺NH₂CH₂CH=CH₂反应，引入C=C双键，制备成可聚合的螯合物单体；再与EuCL₃反应，转化为基于铕离子发光原理的可聚合荧光螯合物单体；然后采用分散聚合法结合超声波辐照技术，在聚乙烯吡咯烷酮PVP、偶氮二异丁腈AIBN的参与下，与苯乙烯单体共价结合，制备出小粒径聚苯乙烯荧光微球；最后采用十一烯酸包覆法，利用微球表面的双键与十一烯酸的双键共聚，实现十一烯酸在微球表面的包覆，从而制备出羧基聚苯乙烯荧光微球；该微球直径为70～100 nm，变异系数CV值＜5%，激发和发射波长分别为365 nm和615 nm。

4.根据权利要求2所述检测呕吐毒素及其乙酰化衍生物的时间分辨荧光免疫层析卡的制备方法，其特征在于步骤（2）中使用的呕吐毒素单克隆抗体1和抗体2，是分别采用抗呕吐毒素杂交瘤细胞株SW-3 F4及SW-3 G12，经过体外培养、小鼠腹腔注射、采集腹水、提取纯化、抗体特异性鉴定而获得的；其中，抗体1与呕吐毒素DON交叉反应率100%，与15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇15-Ac-DON的交叉反应率≥100%，对DON和15-Ac-DON表现出高度的特异性；抗体2与呕吐毒素DON交叉反应率100%、与3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇3-Ac-DON的交叉反应率≥100%，对DON和3-Ac-DON表现出高度的特异性。