[发明专利]一种枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂生产方法

说明书

一种枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂生产方法，包括以下步骤：基因编辑法定向突变和/或敲除生产枯草芽孢杆菌的特定营养基因，构建基因编辑载体；转化目标枯草芽孢杆菌，筛选成功基因编辑的特定营养物依赖型菌作为生产菌；筛选出上述特定营养物的普通枯草芽孢杆菌作为营养菌；分别培养所述生产菌与营养菌，作为菌剂生产发酵的种子菌；将营养菌和生产菌混合进行菌剂生产的规模培养即得。本发明采用基因编辑法对重要商用价值的枯草芽孢杆菌生产菌进行特定营养物质合成基因的定向突变和敲除，可以有效培育出特定营养物质依赖型的生产菌菌种，降低商业菌剂中菌种扩散和流失的风险。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂生产方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，是芽孢杆菌属的一种，属革兰氏阳性菌。常作为发酵表达特定蛋白的表达菌，如蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶及核苷酸酶生产；也可作为一种益生性细菌直接利用细菌菌剂，尤其该菌能以芽孢状态耐受氧化、酸碱和高温(120℃温度下存活20分钟以上)，使其适应一些严苛的环境条件而体现出独特优势。因此枯草芽孢杆菌在酶制剂发酵、饲料添加、生物肥生产、污水处理、有机废弃物处理等多领域都具有广泛的应用。

通过对自然界中枯草芽孢杆菌的分离筛选及遗传改良，已有多种枯草芽孢杆菌的标准菌种，如纳豆工业生产菌种的枯草芽孢杆菌亚种Bacillus subtilis subsp.subtilisCICC 23916、药用菌种Bacillus subtilis CICC 10275(中国工业微生物菌种保藏管理中心)等。更有大量生产用枯草芽孢杆菌菌种在生产中发挥其独特功能，如李晶晶等从牛瘤胃中分离的枯草芽孢杆菌YB-6、包文庆等分离的降解超富集植物的枯草芽孢杆菌BS-C3、余贤美等分离的防治柿树炭疽病的枯草芽孢杆菌Bs-15等。加之枯草芽孢杆菌作为安全的生产菌，还是基因工程表达外源蛋白质的良好受体，一大批转基因枯草芽孢杆菌得以培育并应用于目标蛋白质(酶)的发酵生产。

对于直接利用菌剂作为商品应用形式的制剂，很容易使珍贵菌种扩散流失。生产商为了保护自身利益，常采取一些专门技术防范菌种的扩散流失。如利用抗生素抗性保种、逃逸性质粒选择、特定营养物质依赖等措施。然而，上述方法的技术含量不高，易于通过抗生素筛选、选择压力加持或添加特定营养物简单破解。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂生产方法，包括以下步骤：

1)、基因编辑法定向突变和/或敲除生产枯草芽孢杆菌的特定营养基因，构建基因编辑载体；

2)、将构建的基因编辑载体转化到目标枯草芽孢杆菌，筛选成功基因编辑的特定营养物依赖型菌作为生产菌；

3)、针对特定营养物筛选出分泌步骤2)所述特定营养物的普通枯草芽孢杆菌，作为营养菌；

4)、分别培养所述生产菌与营养菌，作为菌剂生产发酵的种子菌。

5)、将营养菌和生产菌混合进行菌剂生产的规模培养即得。

优选地，本发明所述的枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂生产方法中，所述枯草芽孢杆菌的特定营养基因包括简单营养物合成代谢相关酶的基因。

优选地，本发明所述的枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂生产方法中，所述枯草芽孢杆菌的特定营养基因包括氨基酸合成酶基因、核苷酸合成酶基因或生物素合成酶基因的一种或几种。

优选地，本发明所述的枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂生产方法中，所述基因编辑法包括采用CRISPR-Cas9系统针对特定营养基因的基因编辑方法。