[发明专利]一种高产L-赖氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法

权利要求书

1.一种高产L-赖氨酸的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述重组菌异源表达了来源于嗜热微生物的二氨基庚二酸脱氢酶。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述二氨基庚二酸脱氢酶为以下任一：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有80％以上同源性，且具有二氨基庚二酸脱氢酶活性。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述嗜热微生物为嗜热纤维梭菌、嗜热球形脲芽孢杆菌或嗜热共生杆菌。

4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以生产L-赖氨酸的大肠杆菌为宿主。

5.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以pKO3-Km作为表达载体。

6.权利要求1～5任一所述重组菌的构建方法，其特征在于，所述方法具体是：

(1)重组表达载体pDXW-8/ddh_Ct的构建

将ddh_Ct片段与经相同限制性内切酶酶切后的C.glutamicum-E.coli穿梭表达质粒pDXW-8相连构建重组质粒pDXW-8/ddh_Ct；

(2)表达框Ptac-ddh_Ct-rrnBT1T2的获取

以pDXW-8/ddh_Ct为模板，进行PCR，获得Ptac-ddh_Ct-rrnBT1T2表达框；

(3)整合型载体pKO3-Km/ΔdapD::ddh_Ct的构建

以E.coli LATR11基因组为模板设计引物，进行PCR，获得分别在3’端和5’端有相同限制性内切酶的PCR产物，将以上述PCR产物分别与线性化pKO3-Km自杀型载体相连构建重组质粒pKO3-Km/ΔdapD；随后将将纯化后的PCR产物Ptac-ddh_Ct-rrnBT1T2与pKO3-Km/ΔdapD连接，获得重组质粒pKO3-Km/ΔdapD::ddh_Ct；

(4)重组菌株E.coli LATR11ΔdapD::ddh_Ct的构建

将质粒pKO3-Km/ΔdapD::ddh_Ct电击转化E.coli LATR11，筛选得到重组菌E.coliLATR11ΔdapD::ddh_Ct。

7.权利要求1～5任一所述重组菌发酵生产L-赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法是将所述重组菌单菌落接种至液体种子培养基，35-38℃，80-120r·min^-1培养10-14h；以5-15％接种量将种子培养液转接至发酵培养基，35-38℃，80-120r·min^-1培养30-50h。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述种子培养基为：葡萄糖15-25g·L^-1，玉米浆5-15g·L^-1，(NH₄)₂SO₄5-15g·L^-1，KH₂PO₄1-2g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.5-1.5g·L^-1，FeSO₄·7H₂O 0.05-0.15g·L^-1，MnSO₄·4H₂O 0.05-0.15g·L^-1，L-苏氨酸0.5-1.5g·L^-1，生物素0.0004-0.0008g·L^-1，CaCO₃15-25g·L^-1。