[发明专利]一种HBV中HBx蛋白核心区段的可溶化和纯化及单克隆抗体

权利要求书

1.一种HBx蛋白核心区段HBxΔNΔC包涵体的可溶化和纯化方法，其特征在于，是将含HBxΔNΔC序列的质粒转化到大肠杆菌Rosetta菌株进行重组表达得到HBxΔNΔC包涵体，然后对该HBxΔNΔC包涵体进行可溶化与纯化，在这过程中不使用还原剂，使用pH 4.0-5.0的偏酸性缓冲液，并添加1-20 mM的氧化剂，得到有活性、稳定、均一、高纯度、主要以单体形式存在的HBxΔNΔC蛋白样品。

2.根据权利要求1所述的HBx蛋白核心区段HBxΔNΔC包涵体的可溶化和纯化方法，其特征在于，具体操作步骤如下：

（1）重组表达HBxΔNΔC包涵体的大肠杆菌收集后，用裂解缓冲液在循环液冷却破菌机中破菌3-4次，之后离心收集含有HBxΔNΔC包涵体的不溶物；裂解缓冲液成分为：pH 7.5-9.0的10-200 mM Tris-HCl，2.0-3.5 M 尿素或硫脲，100-2000 mM 氯化钠；

（2）使用洗涤缓冲液重悬、洗涤含有HBxΔNΔC包涵体的不溶物2-3次；从1L培养基得到的含包涵体的不溶物使用的洗涤缓冲液为15-100 ml；洗涤缓冲液成分为：pH 7.5-9.0的10-200 mM Tris-HCl，3.0-3.5 M 尿素或硫脲，100-2000 mM 氯化钠；

（3）使用20-40 mL溶解缓冲液将获得的包涵体沉淀碾匀后在室温下重悬搅拌均匀，之后离心取上清；溶解缓冲液成分为：5-8 M尿素或硫脲，20-70 mM 咪唑；

（4）使用亲和层析Ni柱纯化得到变性条件下的HBxΔNΔC；其中，Ni柱的上样缓冲液，即上述的溶解缓冲液，成分为：5-8 M尿素或硫脲，20-70 mM 咪唑；Ni柱洗脱缓冲液成分为：5-8 M尿素或硫脲，200-800 mM咪唑；

（5）使用透析的方式将变性的HBxΔNΔC进行复性：将前述得到的变性的HBxΔNΔC样品置于0.2-2 L的透析液中透析1-6 h，并换新鲜的透析液重复透析2-3次，透析过程置于-4-15℃冷柜中；其中，复性透析液组份为：pH 4.0-5.0的10-500 mM 醋酸钠，50-500 mM 氯化钠，1-20 mM 氧化剂过氧化氢；

（6）复性后的HBxΔNΔC样品通过Superdex 75或Superdex 200分子筛进行纯化，之后将HBxΔNΔC浓缩到5-30 mg/ml，完成制备过程；其中，分子筛缓冲液和浓缩缓冲液使用步骤（5）中的复性透析液。

3.一种乙型肝炎病毒蛋白HBx截断体HBxΔNΔC的单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1或2所述方法得到的HBxΔNΔC作为抗原，使用通常的单克隆抗体制备方法而获得。

4.根据权利要求3所述的乙型肝炎病毒蛋白HBx截断体HBxΔNΔC的单克隆抗体，其特征在于，包括：

鼠源的HBxΔNΔC单克隆抗体，由权利要求1或2所述得到的有活性的HBxΔNΔC作为抗原，注射小鼠而获得；专一作用于HBx和HBxΔNΔC，作为科研试剂和检测试剂；

鼠源以外的其它动物来源的HBxΔNΔC单克隆抗体，由权利要求1或2所述得到的有活性的HBxΔNΔC作为抗原，注射鼠源以外的其它动物而获得；专一作用于HBx和HBxΔNΔC，作为科研试剂和检测试剂；

人源化的HBxΔNΔC单克隆抗体，由上述动物来源的单克隆抗体，使用通常的抗体人源化方法而获得；专一作用于HBx或HBxΔNΔC，可直接应用于人体，作为科研试剂、检测试剂和辅助治疗制剂。