[发明专利]一种血吸虫虫卵抗原的制备及纯化方法

说明书

本发明涉及一种血吸虫虫卵抗原的制备及纯化方法，采用腹部玻片法以日本血吸虫尾蚴感染新西兰白兔，饲养后解剖，取出肝脏组织用剪刀剪成细块状，加生理盐水破碎匀浆，过φ20cm的60‑120目铜筛，过φ20cm的160‑300目尼龙绢，收集300目上的血吸虫虫卵；加生理盐水，搅拌静止沉淀用吸管去杂，过φ20cm的200和300目尼龙绢，蒸馏水冲洗，收集300目上的虫卵研磨，低温冻干，石英研磨钵碾磨后过φ20cm的300‑400目铜筛，破碎匀浆，再用高速离心机，低温离心吸取上清液，得乳白色血吸虫虫卵抗原。采用本发明纯净血吸虫虫卵得率高，所得血吸虫虫卵中不包含大小接近的破碎肝组织、破碎虫卵，虫卵抗原中杂蛋白含量低。

技术领域

本发明涉及涉及抗原制备技术领域，具体涉及一种血吸虫虫卵抗原的制备及纯化方法。

背景技术

血吸虫病是一种人和动物都能受传染的寄生虫病，危害程度较大。目前，我国血吸虫病诊断标准中(WS261-2006)主要包括酶联免疫法、胶体金免疫层析法、间接血凝法和渗滤法。纯净虫卵制备的SEA中，特异性蛋白组分主要集中在10-20kDa，采用大孔树脂、透析袋等处理方式可实现将肝组织细胞蛋白、破碎虫卵变性蛋白与纯净虫卵蛋白分离，实现特定分子量蛋白纯化，但均存在耗时较长、SEA得率低的问题。

制备血吸虫虫卵抗原的一般步骤为：采用腹部玻片法以日本血吸虫尾蚴感染新西兰白兔，饲养45d后解剖，取出肝脏组织；肝脏组织用剪刀剪成细块状，加生理盐水破碎匀浆，通过直径为20cm的160、200和300目尼龙绢，收集300目尼龙绢上保留的血吸虫虫卵；加生理盐水，搅拌静止沉淀用吸管除去悬浮杂质，通过直径为20cm的200和300目尼龙绢，蒸馏水冲洗，收集300目尼龙绢上保留的虫卵倒入细胞匀质器中破碎匀浆，再用高速离心机，离心吸取上清液，即得到乳白色血吸虫虫卵抗原。

该方法直接采用160目-300目尼龙绢布逐步滤取纯净血吸虫虫卵时，溶液中包含的大块破碎肝组织无法顺利通过尼龙绢布，同时阻塞虫卵通过，造成过滤耗时长，纯净血吸虫虫卵得率低，一般为1.78g±0.16g(每1kg原料)。300目尼龙绢布过滤得到的虫卵中纯净虫卵得率低，破碎肝组织、破碎虫卵未完全分离，从而造成制得的SEA组分中包含肝组织细胞蛋白、破碎虫卵蛋白等杂蛋白。由于破碎虫卵中蛋白在长时间的制备流程中可能会发生氧化变性或自然降解，且与纯净虫卵制备的蛋白具有一定的相似性。含杂蛋白的SEA会造成后续的检测方法特异性和敏感性不高，可能出现假阳性，如与并殖吸虫病和华支睾吸虫病等其它寄生虫病如存在一定程度的交叉反应；还可能出现漏检，如病人感染度处于较低水平，若采用不纯抗原，则结果为阴性。

CN103076447B一种血吸虫虫卵粗抗原纯化方法，采用Sephacryl S-300HR柱层析分离血吸虫虫卵粗抗原，去除分子量10kDa组分。较佳地，最后用截留10kDa分子量的超滤管进一步分离纯化。收集血吸虫虫卵，加入生理盐水制成匀浆，然后超声粉碎并离心，所得上清即为血吸虫虫卵粗抗原。还提供了血吸虫虫卵纯化抗原、其应用以及血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒

CN102079781A公开了一组日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白,该免疫原性蛋白选自SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。还公开了日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白的筛选方法和用途,主要通过联合蛋白质组学技术和血清学方法筛选日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白,具体涉及利用双向电泳、Westernblot(2D-WB)以及质谱的方法分析日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白,并以此作为日本血吸虫病诊断的潜在靶点

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，旨在提供一种能提高纯净的血吸虫虫卵得率，得到的血吸虫虫卵中不包含大小接近的破碎肝组织、破碎虫卵，所制备出的血吸虫虫卵粗抗原中杂蛋白含量低，后续产品在储藏期稳定的血吸虫虫卵抗原的制备及纯化方法。

本发明目的的实现方式为，一种血吸虫虫卵抗原的制备及纯化方法，具体步骤如下：