[发明专利]5号染色体上与水稻耐盐QTL紧密连锁的SSR标记的挖掘及应用

权利要求书

1.5号染色体上与水稻耐盐QTL紧密连锁的SSR标记的应用，其特征在于：用SSR标记RM593引物：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2扩增水稻耐盐鉴定材料，如果用SSR标记RM593引物：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2能够扩增出205bp的扩增片段，则标志着待鉴定水稻材料内存在耐盐位点qPFW-2；水稻优良耐盐资源的QTL挖掘包含以下步骤：

（1）以水稻优良耐盐资源海湘030为母本，盐敏感水稻品种连粳4号为父本，配制杂种F1，构建了包含189个单株的F2分离群体，F2单株自交获得F2:3家系；

（2）对F2:3家系采用稻池盐害鉴定方法，检测指标选择水稻分蘖盛期时植株鲜重（plant fresh weight，PFW），获得各个家系和亲本的耐盐指数；

（3）采用SDS粗提法提取亲本、F1及F2:3定位群体单株的DNA，用实验室已有的大体平均分布于水稻12条染色体的368对SSR引物，对亲本、F1及F2:3定位群体进行PCR扩增，检测多态性引物，用筛选到的162对多态性SSR引物检测F2:3家系；

（4）根据F2:3家系各单株SSR引物多态性检测结果和耐盐表型参数，用 Mapmaker/Exp3.0软件进行SSR标记的定位连锁分析，利用Kosambi作图函数将交换率转换为遗传距离（CM），采用基于复合区间作图法软件Windows QTL Cartographer V2.5检测水稻耐盐QTL，LOD值的阈值定为2.0，按P＝0.005概率值检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置；

（5）获得水稻优良耐盐资源海湘030耐盐QTL位点qPFW-2，位于第5号染色体分子标记RM593与RM574之间，通过检测5号染色体上该2个引物标记的带型数据，可以预测该植株的耐盐性，加快了耐盐水稻的筛选效率。

2.根据权利要求1所述的5号染色体上与水稻耐盐QTL紧密连锁的SSR标记的应用，所述的稻池盐害鉴定方法具体方案为：

（1）盐池准备：采用不锈钢材料建造盐池，盐池为高35cm、宽35cm、长2.5m的长槽，底部和周围均密封，长槽周边采用钢筋焊接固定，将非盐化泥土粉碎、过筛后晒干，每个盐池均加入等量200 kg的非盐化泥土，分别设置盐害处理组和对照组，盐害处理组采用0.5%的NaCl盐溶液80 kg浸土，对照组采用等量普通自来水浸土；

（2）将催芽后的水稻种子播于盐池中：将待鉴定水稻材料一起浸种、发芽，取出出芽一致的供试材料分别播种于盐害处理组和对照组中的盐池中，每槽种植2行，行距10cm，点播间距8cm，每份材料点播50粒，生产管理方式采用常规直播栽培管理方式，不移栽；待水稻分蘖盛期时将植株挖出，洗净根部泥土，控水后分别称量每份材料盐害组和对照组植株鲜重（plant fresh weight，PFW），每份材料盐害组和对照组各称量30株；

（3）计算耐盐指数：计算每份材料的PFW平均值，进一步计算耐盐指数，耐盐指数=盐害处理组单株鲜重均值/对照处理组单株鲜重均值；用每份材料的耐盐指数作为定位群体的表型参数。

3.根据权利要求1所述的5号染色体上与水稻耐盐QTL紧密连锁的SSR标记的应用，所述的对亲本、F1及F2:3定位群体进行PCR扩增的PCR反应体系为：总体积为20µL，反应液组成为10×PCR buffer2µL，10mmol/L dNTPs 1.2µL，引物各50ng，基因组DNA50ng，1.0U Taq DNA聚合酶，补水至20µL，所述10×PCR buffer为200mmol/L Tris-HCl pH8.0，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl₂，stabilizers；PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性0.5min，55℃退火复性1min，72℃延伸50-90s，共35个循环；最后72℃保温10min；扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）银染检测。

4.根据权利要求1所述的5号染色体上与水稻耐盐QTL紧密连锁的SSR标记的应用，所述的应用指的是在滨海滩涂盐土地、内陆盐土地、黄淮海平原盐土地、松嫩平原盐碱土地和青新漠境盐土地的水稻种植与新品种培育。