[发明专利]量子点荧光探针及其制备方法和应用以及检测弹性蛋白酶活性的方法和试剂盒

说明书

本发明涉及弹性蛋白酶活性检测领域，具体涉及量子点荧光探针及其制备方法和应用以及检测弹性蛋白酶活性的方法和试剂盒。量子点荧光探针包括核壳结构的半导体量子点，罗丹明衍生物及连接在半导体量子点和罗丹明衍生物之间的弹性蛋白酶特异性多肽；半导体量子点以CdSe为核以ZnS为壳。制备方法包括：将EDC和NHS与半导体量子点接触，以对半导体量子点表面的羧基活化；将得到半导体量子点表面的活化羧基与连接有罗丹明衍生物的蛋白水解酶特异性多肽的氨基反应，得到量子点荧光探针。本发明的量子点荧光探针在用于检测蛋白水解酶特别是弹性蛋白酶活性时，与蛋白水解酶具有更高的亲和力，检测的有效性更高。

技术领域

本发明涉及弹性蛋白酶活性检测领域，具体涉及一种量子点荧光探针，该量子点荧光探针的制备方法和应用，以及一种检测弹性蛋白酶活性的方法和试剂盒。

背景技术

弹性蛋白酶的主要功能是水解胞外弹性蛋白，使免疫细胞能够快速到达炎症部位清除病原体，但是如果弹性蛋白酶活性过高的话就会引发一系列肺部疾病，比如慢性阻塞性肺病，包括肺气肿、慢性支气管炎以及哮喘，还会使肺囊泡纤维化，使呼吸功能逐渐衰竭，除此之外，过多的弹性蛋白还会水解免疫蛋白，使机体的免疫能力下降从而引发肺癌。

而目前用于检测弹性蛋白酶活性的探针主要是通过它的紫外底物NMeOSuc-AAPV-pNA，荧光底物NMeOSuc-AAPV-AMC，以及基于香豆素的小分子荧光探针，除此之外还有基于荧光蛋白或者多肽底物的FRET探针，不过这些探针在应用方面都有一定的局限，首先是检测限，这些探针的检测限都在纳摩尔水平，而患者支气管肺泡灌洗液中弹性蛋白酶的活性往往很低难以被检测到，除此之外，这些探针几乎都难以被应用到细胞甚至活体水平，所以应用被限制，因此开发高灵敏度而且能应用于细胞和活体水平的探针十分有必要。

发明内容

本发明的目的在于克服目前现有技术中存在的上述缺陷，提供一种性质稳定、操作简单、易于储运、灵敏度更高、选择性更好以及可以应用于细胞、血清、尿液、甚至活体水平的弹性蛋白酶活性检测荧光探针及其应用。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种量子点荧光探针，该量子点荧光探针包括核壳结构的半导体量子点，罗丹明衍生物以及连接在所述半导体量子点和所述罗丹明衍生物之间的弹性蛋白酶特异性多肽；

其中，所述半导体量子点为以CdSe为核以ZnS为壳的CdSe@ZnS半导体量子点。

优选的，所述半导体量子点的表面还修饰有聚乙二醇。

优选的，所述聚乙二醇为带有羧基的聚乙二醇。

优选的，所述罗丹明衍生物为磺酰罗丹明B。

优选的，所述弹性蛋白酶特异性多肽的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

本发明第二方面提供了如上所述的量子点荧光探针的制备方法，该方法包括：

(1)将碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺与所述半导体量子点进行接触，以对所述半导体量子点表面的羧基进行活化；

(2)将步骤(1)得到半导体量子点表面的活化羧基与连接有罗丹明衍生物的弹性蛋白酶特异性多肽的氨基进行反应，得到所述量子点荧光探针。

本发明第三方面提供了如上所述的量子点荧光探针在检测弹性蛋白酶活性中的应用。

本发明第四方面提供了一种检测弹性蛋白酶活性的方法，该方法包括：将含有弹性蛋白酶的待测样品与如上所述的量子点荧光探针接触，得到接触后的物料；

检测接触后的物料在激发光下发出的荧光强度F_535nm/F_590nm随时间的增加值，所述荧光强度的增加值指示了待测样品中弹性蛋白酶的活性；