[发明专利]霉菌的培养方法、破壁方法及DNA提取方法

权利要求书

1.一种霉菌的培养方法，其特征在于它按照如下的步骤顺序进行：

（1）霉菌菌丝的收集

将马铃薯洗净、去皮，称取200ɡ切成小块，添加500mL去离子水煮烂之后用八层纱布过滤，于过滤汁中添加16～20ɡ琼脂和20g葡萄糖，冷却后定容至1000mL，加盖密封，115℃灭菌20min后，冷却至50℃后倾倒平板，得马铃薯琼脂培养基；

将冷藏于4℃冰箱中的霉菌接种于马铃薯琼脂培养基的平板上，28～30℃恒温培养48h；之后，

再转接于新鲜马铃薯琼脂培养基，如此重复2～3次，得活化后的霉菌；

（2）活化好的霉菌再次转接于新鲜的马铃薯琼脂培养基上，28～30℃恒温培养48 h后，利用锋利的灭菌刀片刮取平板上的菌丝，得到霉菌菌丝体。

2.一种霉菌的破壁方法，其特征在于它包括顺序进行的以下步骤：

①在研磨容器中加入第一CTAB抽提液a1，将所述研磨容器进行冷冻，使所述a1变为冰冻态；然后，

②在研磨容器中加入霉菌菌丝体及第二CTAB抽提液a2；以及

③对所述霉菌菌丝体进行研磨后，并与第一CTAB抽提液a1、第二CTAB抽提液a2共同形成第一混合溶液b1。

3.根据权利要求2所述的霉菌的破壁方法，其特征在于：所述步骤①中，冷冻的温度为-30～-15℃，时间为1～1.5h。

4.根据权利要求2所述的霉菌的破壁方法，其特征在于：第一CTAB抽提液a1、霉菌菌丝体与第二CTAB抽提液a2的用量比为1mL：0.5～2g：0.5～2mL。

5.根据权利要求2所述的霉菌的破壁方法，其特征在于：第一CTAB抽提液a1与第二CTAB抽提液a2均为CTAB抽提液，即液体a，第一CTAB抽提液a1与第二CTAB抽提液a2的体积相同。

6.根据权利要求5所述的霉菌的破壁方法，其特征在于：所述液体a由 CTAB、氯化钠、EDTA溶液、Tris-HCL缓冲液及β-巯基乙醇以1ɡ：4.09ɡ：2mL：5mL：0.25ɡ的比例制得，先由CTAB、氯化钠、EDTA溶液、Tris-HCL缓冲液混合后由蒸馏水定容，121℃灭菌15min，冷却后加入β-巯基乙醇，即成；其中：

EDTA溶液、Tris-HCL缓冲液的浓度分别为0.5M、1M；

蒸馏水定容后的体积与CTAB的用量比为50 mL：1ɡ。

7.一种霉菌DNA的提取方法，其特征在于它包括顺序进行的如下步骤：

ⅰ.通过权利要求2-6任一项所述的霉菌的破壁方法得到第一混合溶液b1；

ⅱ.在第一混合溶液b1中加入质量体积浓度为10%的SDS溶液d，进行温浴后，形成第二混合溶液b2；

第二混合溶液b2进行离心，得到第一上清液c1，所述第一上清液c1中含有所述霉菌的DNA；

ⅲ.第一上清液中c1中加入苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e1，混匀后离心，得到含有所述霉菌的DNA的第二上清液c2。

8.根据权利要求7所述的霉菌DNA的提取方法，其特征在于：所述SDS溶液d与所述第一混合溶液b1的体积比为1：8～12，10%SDS溶液只要少量即可，使得蛋白质变性后与DNA分开。

9.根据权利要求7所述的霉菌DNA的提取方法，其特征在于：所述温浴的温度为50-80℃，时间为20～30min。

10.根据权利要求7所述的霉菌DNA的提取方法，其特征在于：所述苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e1与所述第一上清液c1的体积比为1：0.8～1.2。

11.根据权利要求7所述的霉菌DNA的提取方法，其特征在于：离心的转速为5000～8000r/min，离心时间为5～6min。