[发明专利]利用Crispr技术敲除Cosmc基因构建的O-型糖基化异常的结肠癌细胞系

说明书

本发明公开了利用Crispr技术敲除Cosmc基因构建的O‑型糖基化异常的结肠癌细胞系。本发明的O‑型糖基化异常的结肠癌细胞系的制备方法包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对结肠癌细胞基因组中的Cosmc基因进行编辑，进而使所述T‑synthase功能丧失，得到O‑型糖基化异常的结肠癌细胞系。本发明使用慢病毒做中间媒介敲除结肠癌细胞内Cosmc基因，代替了质粒直接转化细胞，更高效地发挥Crispr/Cas9的敲除作用。为研究异常的O‑型糖基化对于结直肠癌发生发展的影响奠定基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及利用Crispr/Cas9系统构建的敲除Cosmc基因的结肠癌细胞系，特别涉及利用Crispr/Cas9系统靶向编辑Cosmc基因制备O-型糖基化异常的HCT116和SW840结肠癌细胞系的方法。

背景技术

糖链的修饰是重要的蛋白质翻译后修饰，黏蛋白O型糖基化是其中重要的类型之一。黏蛋白型O-聚糖通过一个在高尔基体发生的连续糖基转移作用合成，而合成的过程由一套糖基转移酶催化。T-synthase是合成O-聚糖核心1的唯一糖基转移酶，它主要的功能是将半乳糖添加到Tn抗原糖链上。但是在人体和其他脊椎动物中有活性的T-synthase的形成需要一个重要的伴侣分子Cosmc，它帮助T-synthase折叠形成正确的蛋白质三级结构。Cosmc功能丧失将直接导致T-synthase失活，其结果是机体细胞只能合成Tn抗原以及唾液酸化的sTn抗原。

已有研究发现在结直肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌组织中高表达Tn抗原，Tn抗原的暴露于肿瘤的发生发展有密切联系。目前大部分结肠癌细胞系均为O-型糖基化正常的细胞系，为了研究O-型糖基化在肿瘤中的功能与机制，需要在体外构建可稳定遗传的异常型O-型糖基化细胞系。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种O-型糖基化异常的结肠癌细胞系的制备方法。

本发明提供的O-型糖基化异常的结肠癌细胞系的制备方法包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对结肠癌细胞基因组中的Cosmc基因进行编辑，进而使所述T-synthase功能丧失，得到O-型糖基化异常的结肠癌细胞系。

上述方法中，所述CRISPR/Cas9系统包括sgRNA；所述sgRNA的靶序列具体可为Cosmc基因的第55-74位。

上述方法中，所述编辑的方法为向所述结肠癌细胞中导入Cosmc基因编辑的慢病毒载体；所述Cosmc基因编辑的慢病毒载体含有所述sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因。

进一步的，所述Cosmc基因编辑的慢病毒载体为将双链DNA分子插入慢病毒表达载体的酶切位点间得到的载体；所述双链DNA分子是将单链DNA分子甲和单链DNA分子乙退火制备得到的；

所述单链DNA分子甲的核苷酸序列如序列1所示；

所述单链DNA分子乙的核苷酸序列如序列2所示。

更进一步的，所述Cosmc基因编辑的慢病毒载体为将所述双链DNA分子插入LentiCRISPRV2载体的BsmBI酶切位点间得到的载体。

上述方法中，所述结肠癌细胞为结肠癌细胞HCT116或结肠癌细胞SW840。

本发明的另一个目的是提供按照上述方法制备得到的O-型糖基化异常的结肠癌细胞系。

本发明还有一个目的是提供上述Cosmc基因编辑的慢病毒载体。

上述Cosmc基因编辑的慢病毒载体在制备O-型糖基化异常的结肠癌细胞系中的应用也属于本发明的保护范围。

上述方法或细胞系或应用中，所述O-型糖基化异常为T-synthase控制的O-型聚糖链延伸异常。