[发明专利]一种百草枯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

说明书

本发明公开了一种百草枯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明经筛选得到一株单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对百草枯具有较好的特异性和检测灵敏度，IC₅₀值为0.97ng/mL，可实现对蔬菜、水资源及土壤中百草枯残留量的检测，为食品中百草枯残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

技术领域

本发明涉及一种百草枯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

百草枯(paraquat，简写为Para)，化学名称为1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐，是一种速效触杀型灭生性除草剂，由于对绿色植物组织有很强的破坏作用而在农业中被推广应用。目前，百草枯在全世界的使用已经超过100个国家，其用量仅次于除草剂草甘膦，也是我国进口量最大的农药品种之一。由于百草枯在土壤中有极强的吸附作用而在土壤中产生残留，并对水资源产生严重污染，且百草枯对人毒性极大，并无特效解毒药，口服中毒死亡率可达90％以上，目前已被20多个国家禁止或者严格限制使用。我国自2014年7月1日起，撤销百草枯水剂登记和生产许可、停止生产；但保留母药生产企业水剂出口境外使用登记、允许专供出口生产，停止水剂在国内销售和使用。尽管如此，百草枯中毒现象仍呈逐年上升趋势。在萨尔瓦多，平均每年由于百草枯中毒案件达2万起；在日本，每年百草枯中毒死亡达1000例以上；在我国，据不完全统计，1991-2008年百草枯中毒人数达8370例，并呈增长趋势，但目前临床上仍无有效的治疗手段，中毒死亡率较高。因此，建立百草枯安全、快速、高效的检测方法的研究受到广泛重视。

百草枯的传统检测方法有气质联用法、毛细管电泳法、高效液相色谱法和毛细管电泳质谱联用法等，然而这些方法的前处理比较复杂、费时，不适用于大量样品的快速检测。为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对百草枯的高效、快速的检测方法，而酶联免疫法(ELISA)前处理简单，成本低，可实现大量样品的快速检测，且检测时对样本的纯度要求不高。因此，建立高效的免疫学检测方法很有必要，而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对百草枯的高特异性单克隆单体。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14688，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的第二个目的是提供百草枯单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCCNo.14688的单克隆细胞株分泌产生。

本发明的第三个目的是提供所述百草枯单克隆抗体的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于食品中百草枯残留物的分析检测。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于水体中百草枯残留物的分析检测。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是制备ELISA竞争法检测百草枯的试剂。

本发明的第四个目的是提供所述单克隆细胞株的制备方法，所述方法是将百草枯抗原化，再将百草枯的完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，免疫小鼠，取高效价(OD1.4)，低IC₅₀(小于10ng/mL)的的免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经过ELISA检测，筛选亚克隆获得杂交瘤细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述百草枯抗原化是先合成N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶二溴化物，再经过衍生化反应后引入连接臂获得。

在本发明的一种实施方式中，所述百草枯单克隆抗体杂交瘤细胞株LH1的制备基本步骤为：

1)半抗原的衍生：

原药Mol.Wt:257.159；