[发明专利]一种采用电化学免疫传感器检测S-层蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种采用电化学免疫传感器检测S‑层蛋白的方法。所述的方法为：首先制备表面修饰石墨烯‑壳聚糖/聚多巴胺/S‑层蛋白单克隆抗体，或纳米金/聚多巴胺/S‑层蛋白单克隆抗体的电化学免疫传感器；然后基于直接免疫法原理，以差分脉冲伏安法对待测样品中的S‑层蛋白进行检测。本发明所述的S‑层蛋白检测方法快速、高效、灵敏度高，具有极低的检测限(0.025～0.03ng/mL)和非常宽的线性范围(0.2～5000ng/mL)。

技术领域

本发明属于食品安全检测和分析化学技术领域，具体涉及一种采用电化学免疫传感器检测S-层蛋白的方法。

背景技术

S-层蛋白是存在于细胞膜或细胞壁外的表层蛋白，普遍存在于许多细菌及古生菌表层。有多种乳酸杆菌表面均存在S-层蛋白，关于乳酸菌S-层蛋白的研究主要集中在其提取纯化、功能及作用机制，但针对S-层蛋白的检测方面却鲜少有研究报道。有研究表明嗜酸乳杆菌是具有S-层蛋白的乳酸菌之一。乳酸杆菌S-层蛋白是由蛋白质或者糖蛋白亚基组成，呈规则的晶状排列，形成了能够覆盖整个细胞表面的固态表层。其分子量在21-71kD之间，是已知表层蛋白中分子量最小的一类，占菌体总蛋白的10～15％，一般疏水性氨基酸占31.9～38.7％，含有大量的谷氨酸和天冬氨酸(15％)，赖氨酸的含量也相当高(10％)，极少存在含硫的氨基酸。绝大多数S-层蛋白都是单一的蛋白质或糖蛋白组成的，很少有两种或两种以上蛋白质组成的情况。乳酸杆菌为应用最早、研究最多的益生菌种之一，能够调节肠道微生物区系的平衡，增强机体的免疫力和抵抗力。S-层蛋白在乳酸杆菌黏附过程中起重要作用，因此对乳酸杆菌中的S-层蛋白的检测显得至关重要。

目前，常用蛋白质的检测方法有：凯氏定氮法、分子印迹法、双缩脲法、紫外吸收法等，但这些方法有一个共同的缺点：费时费力、价格昂贵或者需要专业的技术人员操作且操作过程比较繁琐，同时灵敏度较低。

多巴胺(2-(3，4-二羟基苯基)乙胺)是一种重要的儿茶酚胺类神经递质，具有烷基胺和邻苯二酚等官能团，在含有空气的弱碱性溶液条件下，容易发生自聚合反应成为聚多巴胺(PDOP)。聚多巴胺(PDOP)几乎可以在任何材料表面自发地形成膜状结构，具有很高的生物相容性和还原能力，各种金属、金属氧化物、半导体纳米粒子都可以在聚多巴胺(PDOP)膜的表面进行生长；生物分子在聚多巴胺(PDOP)膜的表面也很容易保持其生物活性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种采用电化学免疫传感器检测S-层蛋白的方法，所述方法快速、高效、灵敏度极高，具有极低的检测限和非常宽的线性范围。

本发明的技术方案如下：

一种采用电化学免疫传感器检测S-层蛋白的方法，包括以下步骤：

步骤1)制备修饰有聚多巴胺和S-层蛋白单克隆抗体的复合电化学免疫传感器；

步骤2)标准溶液的配制：配制含有S-层蛋白的磷酸缓冲溶液，作为标准溶液，将含有浓度为0的S-层蛋白的标准溶液作为空白标样；

步骤3)S-层蛋白测定方法的建立：将步骤1)制备的复合电化学免疫传感器浸入步骤2)所述含有S-层蛋白的标准溶液中孵育，孵育后用磷酸缓冲溶液冲洗电化学免疫传感器，在K₃[Fe(CN)₆]溶液中进行差分脉冲伏安扫描，记录其响应电流；以孵育前后响应电流的变化值ΔI对S-层蛋白浓度的对数值lgC作图得ΔI-lgC工作曲线，采用线性回归法得到ΔI-lgC线性回归方程，实现对S-层蛋白的定量检测；

步骤4)S-层蛋白的测定：配置含待测样品的磷酸缓冲溶液，加入步骤2)所述标准溶液，测定其响应电流，采用标准加入法计算出待测样品中S-层蛋白的浓度。