[发明专利]基于天然组织来源的脑组织脱细胞材料的制备方法

说明书

本发明公开了基于天然组织来源的脑组织脱细胞材料的制备方法，将哺乳动物任意大小的脑组织材料经含蛋白酶抑制剂的生理盐水、含蛋白酶抑制剂的PBS、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液、含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得天然组织来源的脑组织脱细胞材料。本发明所采用的脑组织是天然来源的生物材料，具有很好的生物相容性和取材广泛性。采用脱细胞技术获得的脑脱细胞材料不含细胞等抗原物质，可使受体的免疫排斥反应降到最低限度。脱细胞技术在去除异种细胞的同时，可保留原先ECM的完整性，具有良好的细胞外微环境等，可以最大限度的模拟正常脑组织结构。

技术领域

本发明主要涉及用于组织或器官修复及其再生的生物领域，具体是一种天然组织来源脑脱细胞材料的制备方法。

背景技术

大脑和脊髓疾病等中枢神经系统的损伤,给病人和家庭带来极大的痛苦。创伤、变性或遗传障碍会导致的中枢神经系统损伤,例如,亨廷顿氏舞蹈症,帕金森病和癫痫。根据最近的一份报告,每年在美国发生超过140万的创伤脑损伤和12000脊髓损伤。损伤往往导致细胞的退变和死亡。在中枢神经系统疾病和损伤后，为改善功能复苏,新的治疗方案集中于创造一个能促进细胞，组织，器官的再生的微环境。在周围神经系统，包含神经营养因子和支持生长的细胞外基质(ECM)的微环境更有利于再生。但是,当前合成材料作为支架修理纤维束损害由于不能完全模拟正常的纤维束传导通路效果往往不理想。

近年来,新兴技术考虑使用天然脱细胞生物支架作为修复损伤的材料。脱细胞产生的ECM,代表由原居住的细胞的分泌产物，通过整合素和其他细胞表面受体传递功能信号。ECM支架能调控细胞内信号通路、细胞转录相关的细胞表型,细胞和细胞增殖分化。这些特性使ECM对许多组织的重构治疗包括心肌，肾脏，下尿路，肌肉-腱组织，食道和神经系统具有广泛的潜在应用。而目前尚无脑脱细胞材料的制备和报道。

冻融法与化学物质相结合的技术来获取组织ECM被认为是最好的方法之一。因此本发明通过冻融法与化学物质相结合的脱细胞技术制备了一种天然组织来源的脑脱细胞支架，在中枢神经系统再生组织工程中有极大的意义。

发明内容

本发明目的在于填补现有技术中，尚无脑脱细胞支架制备的报道，提供一种具有极低免疫原性的，ECM保留完整的天然组织来源的脑脱细胞材料的制备方法。

天然动物或人组织来源的脑脱细胞材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)取宰杀12h以内任意哺乳动物脑组织，取一定大小的脑组织，用含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液漂洗3次，每次30min，去除血液，贴附的脂肪碎片和其他杂质。

(2)在含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡4-14小时；然后用液氮冻融3个循环(-80℃/37℃)；

(3)在含Triton X的PBS缓冲液中，加入混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡4-12小时；

(4)在含SDS的PBS缓冲液中，加入混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡4-12小时；

(5)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入混合抗菌液，37o C摇床120rpm震荡4-12小时；

步骤(2)-(6)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时。

作为优选，所述含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液，蛋白酶抑制剂浓度为10-50K IU/ml；

作为优选，所述含Triton X的PBS缓冲液为浓度0.05％-1％的Triton X-100或Triton X-200的PBS缓冲液；

作为优选，所述含SDS的PBS缓冲液为浓度0.02％-0.15％的SDS的PBS缓冲液；