[发明专利]基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法及其应用

说明书

本发明涉及植物培育技术领域，特别是一种基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法及其应用。本发明是一种可靠，快速的鉴定方法，可以在苗期进行。也可以在人工气候箱中按照白粉病的发病条件，提供准确的发病所需要的温度、湿度、光照等环境条件。通过生物技术方法，快速获得在白粉病接种后，材料中CmROR2基因的表达量。通过表达量分析，来确定种质资源的抗白粉病能力。从而达到快速筛选种质资源的目的。

技术领域

本发明涉及植物培育技术领域，特别是一种基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法及其应用。

背景技术

瓜类白粉病在全世界广泛发生。近年来，保护地甜瓜面积逐年扩大，为白粉病病原菌的活体越冬提供了极大的便利，致使白粉病现已成为我国甜瓜栽培过程中的主要病害。白粉病给世界各国的甜瓜生产造成过巨大损失，据报道，美国曾经由于白粉病造成甜瓜产量的重大损失，严重时达到50%，我国甜瓜主产区新疆在50 年代、90 年代中期曾两次大面积发生白粉病，2007 年甘肃、山东，浙江等省甜瓜白粉病也非常严重，给生产造成严重损失。

甜瓜白粉病菌的生理小种众多，分化快，目前已经报道的单丝壳属白粉菌生理小种就有11个。生理小种快速分化，使得抗性材料很难保证对白粉病的持久抗性。所以甜瓜抗白粉病育种相对比较困难。生理小种演替的原因目前尚不清楚，有研究认为这种现象的产生可能是由于抗性适应导致的, 同时认为解决办法就是不断的推出新的抗生理小种的品种。随着分子生物学的发展，人们对抗病分子机理了解越来越透彻，但是与R基因控制植物抗性相比，人们对非寄主抗性分子基础的认识仍然相当滞后。从分子生物学角度开展甜瓜白粉病广谱抗性的研究工作，鉴定分离白粉病相关的基因，解析基因之间的互作关系，对于创新优良抗病种质，开展甜瓜白粉病防控工作具有一定的现实意义。

发明内容

本发明解决现有技术不足提供一种筛选周期短、防控效果好、不污染环境的基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法及其应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：

基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法，包括如下步骤：

A、取白粉病菌源孢子接种在待接种甜瓜叶片上，白粉病菌源在目标甜瓜叶片轻轻摩擦进行接种；

B、目标甜瓜叶片感染后培养三天待白粉病菌源入侵细胞后进行分子生物学鉴定，提取甜瓜感染叶片和未感染白粉病菌的RNA样品；

C、取步骤B中RNA样品1.0-10.0μL，RNA样品加入反转录混合液中，反转录混合液由PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μL、RT Primer Mix 1.0μL、5×PrimeScript Buffer4.0μL和RNase Free dH₂O 4.0μL组成，7℃反应15 min，85℃反应5sec进行酶失活，降温至4℃，制得反转录产物cDNA 模板；

D、利用特定引物进行PCR扩增，特定引物P1为 GCATCGGGATATGCACAAGTC、P2为ATACTCGGTGAGCTATTGATG，冰盒上制备扩增混合液，扩增混合液由5×gDNA Eraser Buffer2.0μL、gDNA Eraser 1.0μL和步骤C中反转录产物cDNA 模板1μL组成，再加入 RNase FreedH₂O至总体积10μL，扩增混合液放置于4℃环境下；

F、冰上融化abm®EvaGreen qPCR MasterMix-ROX 10.0μL、步骤D中的扩增混合液1.6 μL、步骤C中反转录产物cDNA 模板1μL和灭菌蒸馏水dH₂O7.4 μL，并以每分钟2000转进行离心后使用；加入 96 孔板后， 95℃变性10 min，进行循环变性94℃处理15 sec重复40-45 遍；60℃退火处理1min，使用定量 PCR 仪进行分析测定CmROR2基因的表达量；