[发明专利]抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4‑1的单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞JF‑CD4‑1‑2A10，保藏号为：CCTCC NO：C201879，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为：2018年03月29日的杂交瘤细胞分泌的。所述单抗经间接酶联免疫反应实验结果显示单抗能与牙鲆CD4‑1多肽发生特异性结合，免疫间接荧光和流式细胞术表明单抗能特异性识别牙鲆淋巴细胞表面CD4‑1分子，免疫印迹结果显示：本发明的单克隆抗体能特异性识别牙鲆CD4‑1重组蛋白以及分子量约为52 kDa的牙鲆天然CD4‑1蛋白。本发明制备了抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4‑1的单克隆抗体，为检测牙鲆CD4‑1⁺T淋巴细胞提供了重要工具。

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体及其制备方法，具体涉及一种抗牙鲆（Paralichthys olivaceus）T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体及其制备方法，其属于鱼类分子免疫学技术领域。

背景技术

CD4分子为单链跨膜糖蛋白，属Ig超家族成员，主要表达于成熟的T淋巴细胞表面。CD4⁺细胞作为一类重要的T淋巴细胞参与体液免疫和细胞免疫，在抵抗病原入侵等相关免疫防御中发挥着至关重要的作用。CD4⁺ T细胞TCR识别APC表面的外源性抗原肽-MHC类分子复合物后，活化成Th细胞，产生多种细胞因子，趋化和激活其他免疫细胞来清除病原体。CD4分子同样是人类免疫缺陷病毒（HIV）gp120的受体，即HIV可感染CD4⁺细胞，引发获得性免疫缺陷综合征。在哺乳动物中，CD4⁺细胞的特性及免疫功能已研究比较透彻，为开展疾病防治，评价机体免疫状态等开创了新局面。

近年来，关于鱼类CD4分子的研究取得了长足进展，主要集中在CD4分子的基因克隆和基因表达方面。研究发现，鱼类的CD4分子主要有两种类型，即CD4-1和CD4-2分子。CD4-1分子包含4个胞外Ig区，1个跨膜区和1个较短的胞质尾巴，Ig区是其识别抗原肽段的区域。不同鱼类CD4-2分子的胞外Ig区数目存在一定差异，虹鳟和牙鲆CD4-2分子具有2个胞外Ig区，而鲶鱼CD4-2分子含有3个胞外Ig区。鱼类CD4-1和CD4-2分子与高等动物CD4分子相比较均具有保守的胞外样Ig结构域及胞内酪氨酸激酶结合位点P56^lck，而CD4-2分子具有更原始的结构，因此推测在进化过程中由CD4-2分子分化产生了CD4-1分子。温轶等（2010）以河豚为研究模型发现硬骨鱼类中存在类似Treg T细胞，并且表明是CD4-2⁺ T细胞而不是CD4-1⁺T细胞，发挥了类似高等动物CD4的功能。Toda（2011）对鲫鱼研究表明CD4-1⁺淋巴细胞在形态，组织分布和基因表达上与哺乳动物CD4⁺淋巴细胞类似。Kato等（2013）克隆得到了牙鲆CD4-1和CD4-2基因，并在转录水平研究了基因的定位、组织分布及不同病原和免疫原刺激下的动态变化。然而，由于缺少有利的工具来标记CD4⁺ T淋巴细胞，从蛋白水平对鱼类CD4⁺ T淋巴细胞进行分类、鉴定以及关于鱼类CD4⁺ T细胞的免疫学功能都鲜有报道。

牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我国北方重要的海水养殖鱼类，然而近年来频发的养殖病害是妨碍牙鲆养殖业发展的重要因素，疫苗是防治水产病害的一种有效手段。疫苗作用的发挥依赖机体适应性免疫机制的激活，在这一过程中T细胞扮演着重要角色。因此，制备牙鲆CD4分子单克隆抗体，对于检测牙鲆CD4⁺ T淋巴细胞数量变化、评价鱼类细胞免疫应答水平以及研制高效、绿色鱼用疫苗均具有重要现实意义。

发明内容