[发明专利]一种肿瘤耐药性相关蛋白的免疫印迹检测方法

说明书

本发明公开了一种肿瘤耐药性相关蛋白的免疫印迹检测方法，包括以下步骤：S1、提取目的蛋白及电泳：提取目标蛋白样品，制备凝胶，进行电泳；S2、转膜：电泳结束后切下目的蛋白凝胶，按照滤纸、PVDF膜、胶、滤纸由下往上顺序排列，放入半干转膜仪中恒压25V、转印40min；S3、封闭：转膜结束后加入适量封闭液室温振摇孵育30min；S4、抗体孵育：加入稀释后的一抗室温振摇孵育2h，加入稀释后的二抗室温孵育1h；S5、显色：放入凝胶成像仪器中采集信号。本发明针对肿瘤耐药性相关蛋白P‑糖蛋白采用半干转转膜方法，可以节省缓冲液和时间；采用室温静置进行变性处理检测效果更好；采用的一抗和二抗稀释比例能获得较好的蛋白检测信号。

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，具体地说，本发明涉及一种肿瘤耐药性相关蛋白的免疫印迹检测方法。

背景技术

目前恶性肿瘤已成为严重威胁我国居民生活质量的最主要疾病之一。化疗是对恶性肿瘤适用性最广泛的治疗方式，但肿瘤细胞的多药耐药(multipledrugresistance，MDR)特性可造成化疗疗效降低甚至失效。癌细胞对一系列结构各异、药理作用不同的药物产生耐药性，使药物不能在有效浓度内杀灭肿瘤，明显降低了治疗的成功率。肿瘤细胞的多药耐药的产生机制非常复杂，目前认为ABC转运蛋白的3个成员，包括P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、MDR相关蛋白-2(MDR-associatedprotein2，MRP2)和乳腺癌耐药蛋白(breastcancerresistanceprotein，BCRP)与肿瘤的MDR密切相关。

P-糖蛋白(P-gP)为跨膜糖蛋白，是ATP依赖性膜转运蛋白质。研究表明P-gP为单向药物外输蛋白质，耐药癌细胞膜表面高表达，导致细胞内的化疗药物达不到有效浓度。P-gp介导的MDR在众多肿瘤耐药因素中占据重要地位，它是MDR1基因编码的产物，主要分布在细胞膜上，依赖腺苷三磷酸(adenosinetriphosphate，ATP)转运载体，由于在肿瘤细胞中过表达，能将抗肿瘤药物如长春新碱(vinblastine，VLB)、多柔比星和紫杉醇等泵出细胞，限制了这类药物的化疗效果。因此在对癌症耐药性的研究及对患者提供个体化治疗方案时，检测P-gp的表达水平可及早发现恶性肿瘤患者的耐药情况，对耐药肿瘤的化疗提供指导作用。但是由于P-gp结构的特殊性使其检测较其他蛋白的检测更为困难。为此需要开发出一套针对P-糖蛋白免疫印记检测的方法，为肿瘤耐药性机理研究提供检测技术的支持。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供一种肿瘤耐药性相关的P-糖蛋白的免疫印迹检测方法，检测结果可靠灵敏，蛋白信号强。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种肿瘤耐药性相关蛋白的免疫印迹检测方法，包括以下步骤：S1、提取目的蛋白及电泳：提取肿瘤组织标本中的肿瘤耐药性相关蛋白样品，测定蛋白浓度后分装于液氮中保存，制备SDS-PAGE凝胶，15％分离胶灌胶后用异丙醇压线，待分离胶凝聚，加入5％浓缩胶，按15μL体系将6倍SDS上样缓冲液与20μg蛋白样品混合后，再与预染指示剂一同上样，加入1倍Tris-SDS-PAGE电泳缓冲液，进行电泳；S2、转膜：电泳结束后，将目的蛋白所在位置凝胶切下，剪取PVDF膜，按照滤纸、PVDF膜、胶、滤纸由下往上顺序排列，赶走多余气泡，放入半干转膜仪中25V、30min；S3、封闭：转膜结束后加入适量封闭液室温振摇孵育30min；S4、抗体孵育：加入稀释后的一抗室温振摇孵育2h，洗涤液洗去未结合的抗体，5min/次，漂洗5次；加入稀释后的二抗室温孵育1h，洗涤液洗去未结合的抗体，5min/次，漂洗5次；S5、显色：加入1ml超敏发光液室温反应30s，放入凝胶成像仪器中采集信号，观察蛋白的表达。

优选的，步骤S1中采用钙盐沉淀法提取肿瘤组织标本中的肿瘤耐药性相关蛋白。

优选的，步骤S1中所述上样缓冲液与蛋白样品混合后，室温静置10-15min。