[发明专利]DNA纳米四分体实现对核酸高效输送及miRNA的超灵敏检测方法

说明书

本发明提供了DNA纳米四分体实现对核酸高效输送及miRNA的超灵敏检测方法，该检测方法包括如下步骤：(1)根据目标miRNA设计H1纳米四分体和H2纳米四分体，所述H1纳米四分体和H2纳米四分体分别由一个链霉亲和素分子与四个生物素化的荧光发夹探针H1、H2结合形成的；(2)Crosslinking Hybridization Chain Reaction(cHCR)反应，cHCR反应的引发链为miRNA；(3)体外荧光定量分析；(4)细胞内高灵敏成像分析。本发明所述的检测方法核酸输送效率高，通过引发cHCR反应检测目标miRNA，目标miRNA特异性引发的cHCR反应可形成三维交联水凝胶网络，使该反应灵敏度高、并且检测的特异性好，选择性高，为细胞内成像提供高灵敏性和空间分辨率。

技术领域

本发明属于生物化学领域，尤其是涉及一种DNA纳米四分体实现对核酸高效输送及miRNA的超灵敏检测方法。

背景技术

核酸在许多基本的细胞过程中，如遗传信息载体、细胞内调节分子和催化酶等都起着至关重要的作用。因核酸不仅具有标准碱基配对的能力，还可以与各种不同分子进行构象结合，它成为细胞生物学与医药学中一种具有独特的特异性的有价值的调节和分析工具。将核酸应用于生物医学主要是通过转染系统，使其能够有效地输送于不同的细胞中。近年来，DNA/RNA纳米结构已作为一种极具吸引力的核酸的细胞内输送方法，最具代表性的就是球形核酸(SNAs)和自组装核酸纳米结构。这些核酸纳米结构不需要阳离子载体的辅助就可以进入细胞，为在活细胞和体内的开发性诊断分析，治疗性药物输送以及基因调节提供了一个强大的平台。然而，在合成纯化、进入细胞的高效输送以及在细胞内的检测灵敏度等这些方面，DNA/RNA纳米结构仍然存在着重大的挑战。

蛋白质为构建DNA/RNA纳米结构提供了一种有潜力的支架材料。与合成性的纳米粒子不同，蛋白质表面不均匀分布了活性位点，并且蛋白核心具有清楚明确的结构和不同低聚物结构。基于这些优势，以蛋白为核心，利用其的表面胺基和巯基来实现DNA的密集功能化的SNAs已经被设计出来了。这种特殊类型的SNAs不仅能促进细胞对功能性蛋白的摄取，而且还能为精确的调节纳米粒子超晶格结构提供基础。然而，对于这种蛋白质-核酸纳米结构在合成纯化和核酸的高效输送方面几乎没有什么研究。因此，我们构建了一个新型的由SA和四个生物素标记的发夹DNA探针构成的蛋白-核酸纳米结构(DNA nanotetrads)，用于有效的核酸输送。并且，我们结合HCR放大反应，开发了一种基于交联HCR放大方法用于细胞内miRNA检测的通用平台。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出DNA纳米四分体实现对核酸高效输送及miRNA的超灵敏检测方法，以解决细胞内核酸和药物的输送效率低以及miRNA在细胞内的检测灵敏度低等问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

DNA纳米四分体实现对核酸高效输送及miRNA的超灵敏检测方法，该检测方法包括如下步骤：

(1)根据目标miRNA设计H1纳米四分体和H2纳米四分体，所述H1纳米四分体和H2纳米四分体分别由一个链霉亲和素分子与四个生物素化的荧光发夹探针H1、H2结合形成的；

(2)HCR反应，HCR反应的引发链为miRNA；

(3)体外荧光定量分析；

(4)细胞内高灵敏成像分析。

进一步的，所述步骤(1)中H1标记Cy3作为荧光供体，H2标记Cy5作为荧光受体。

进一步的，所述步骤(1)H1纳米四分体和H2纳米四分体的制备方法如下：发夹探针H1和H2先进行淬火预处理，分别将终浓度为2～9μM探针H1和H2在1×PBS缓冲液条件下在95℃加热2～10分钟，然后立即放入冰水中30分钟，然后在室温下继续使用，随后加入适当的SA并适当混匀形成H1纳米四分体和H2纳米四分体。