[发明专利]HLA-B5801等位基因的检测试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及HLA‑B5801等位基因的检测试剂盒及其应用，本发明试剂盒包括检测HLA‑B5801等位基因的qPCR引物和探针，使用本发明引物和探针克服了现有的qPCR方法只能使用多条引物和探针才能把HLA‑B5801等位基因的序列覆盖全，导致qPCR反应体系复杂，结果不稳定的不足。本发明试剂盒使用简单、准确性高、过程可监控、结果快速，而且无电泳过程，利于临床的推广及普及。

技术领域

本发明涉及分子诊断领域，特别涉及HLA-B5801等位基因的检测试剂盒及其应用。

背景技术

高尿酸血症是嘌呤代谢异常，血尿酸生成过多或排泄障碍导致的代谢性疾病，不仅是痛风的主要危险因素，同时也是代谢综合征的重要组成部分，影响心脏、肾脏等脏器功能，是高血压、冠心病的独立危险因素，也是慢性肾功能不全的重要危险因素，对人类健康造成严重危害。

别嘌呤醇等黄嘌呤氧化酶抑制剂，可以减少体内尿酸合成，临床应用于高尿酸血症、痛风和痛风性关节炎等疾病的防治。在对于尿酸生成过多、对排尿酸药物过敏或无效，以及不宜使用排尿酸药物(如有肾功能不全)的原发性和继发性痛风病人，别嘌呤醇是最为适合的药物。所述的别嘌呤醇自1963年起用于临床，其疗效得到了广泛肯定，但有近5％的别嘌呤醇服用患者会出现严重的皮肤不良反应，约占药疹病例的11.94％。严重不良反应包括包括Steven-Johoson综合征(SJS)和中毒性表皮坏死松懈症(TEN)。SJS综合征表现为严重的多形性红斑，可累及皮肤与粘膜，包括口、鼻、眼、阴道、尿道、胃肠道和下呼吸道粘膜，患者甚至有失明危险，进一步发展则形成中毒性表皮坏死松懈症，全身粘膜溃烂，在红斑上发生松弛性大泡或表皮剥离；若遇轻度触碰或牵拉可导致表皮大面积剥离。据报道，SJS/TEN致死率可达30％～50％。研究发现，中国人群中HLA-B5801等位基因与黄嘌呤氧化酶抑制剂引起严重皮肤过敏反应强相关。携带HLA-B5801等位基因的中国汉族患者服用别嘌醇发生皮肤过敏反应的风险较未携带有此基因型的汉族人群风险比增加339倍。美国风湿病学会痛风指南指出中国汉族人和泰国人应用别嘌呤醇药物前应做HLA-B5801等位基因检测。人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，简称HLA)复合体是当前已知的人类染色体中基因密度最高，也是多态性最为丰富的区域。通过基因分析方法区分HLA区域的基因分型，在器官移植、个体化用药方面发挥了巨大作用。

荧光定量PCR方法(qPCR)由于其方法的便捷性，在HLA基因分型上有广泛的应用。特别是分析HLA-B5801等位基因型，荧光定量PCR方法已经见于文献报道和其他的一些专利资料。由于HLA-B5801等位基因序列的丰富性，现有的qPCR方法只能使用多条引物才能把HLA-B5801等位基因的序列覆盖全，导致qPCR反应体系复杂，结果不稳定。

发明内容

本发明为了克服上述提到的qPCR方法中的缺陷，本发明提供一种HLA-B5801等位基因的检测试剂盒，所述试剂盒包括检测HLA-B5801等位基因的以下PCR引物和探针：HLA-B5801上游引物：5'-atgtcccggcccggccgy-3'(SEQ ID NO:1)；HLA-B5801下游引物：5'-caggttctctcggtaagtrt-3'(SEQ ID NO:2)；和HLA-B5801探针序列：5'-ccgcttcatcgcagtgggctacgtg-3'(SEQ ID NO:3)；简并碱基r表示a/g碱基，y表示c/t碱基。

在一种实施方式中，所述HLA-B5801探针序列的荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为MGB。

在一种实施方式中，所述扩增内参基因为人RPP30基因；RPP30上游引物：5'-gatttggacctgcgagc-3'(SEQ ID NO:4)，RPP30下游引物：5'-ggttggccaggcgcgaag-3'(SEQID NO:5)；和RPP30探针的序列为：5'-ctgacctgaaggctct-3'(SEQ ID NO:6)。

在一种实施方式中，所述RPP30探针序列的荧光发光基团为VIC，荧光淬灭基团为MGB。