[发明专利]应用慢病毒载体EF1α启动子优化表达ABCD1基因治疗肾上腺脑白质营养不良症

说明书

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种应用慢病毒载体EF1α启动子优化表达ABCD1基因治疗肾上腺脑白质营养不良症的方法。本发明主要为应用改良优化后的慢病毒载体在EF1α启动子下携带ABCD1基因转染患者自身造血干细胞（HSCs）经回输后实现对ALD的基因治疗，其中根据实际情况可以结合脑内直接注射携带ABCD1基因慢病毒载体方式进行。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种应用慢病毒载体EF1α启动子优化表达 ABCD1基因治疗肾上腺脑白质营养不良症的方法。

背景技术

肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy，ALD)是一种隐性遗传性脂代谢病，由于细胞中过氧化物酶体对VLCFA(very long chain fattyacid)的氧化发生障碍，以致VLCFA 在血、脑白质、肾上腺皮质等器官和组织内大量聚积，引起中枢神经系统脱髓鞘和肾上腺皮质萎缩或发育不良，是一种最常见的过氧化物酶体病，主要累及肾上腺和脑白质，半数以上的病人于儿童或青少年期起病，主要表现为进行性的精神运动障碍，视力及听力下降和(或) 肾上腺皮质功能低下等。本病发病率约为0.5/10万～1/10万，95％是男性，5％为女性杂合子。无种族和地域特异性。

ALD是单基因突变造成的疾病，因此基因治疗方法理论上可以实现对该病的彻底治疗。造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)与间质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs) 具有多项特征使其成为基因治疗中潜在的“运输工具”，HSCs以及MSCs可从血液或者骨髓中获得，并且具有分化成为一系列体细胞以及更新各种组织细胞的能力。然而，在细胞中若ABCD1 基因表达量较低则不能够有效的去除细胞质内VLCFA的异常堆积。

目前国内外应用病毒载体进行基因传递的基因治疗方法虽然有许多，但是不同病毒载体，甚至相同载体的不同制备方法引起的基因传递效率差异明显，而基因传递效率将直接影响疾病的治疗效果。现在大多应用细胞治疗对遗传病进行治疗的方法均存在效率过低以及仅针对血液干细胞进行修饰，使得疾病治疗的临床效果始终达不到预期，因此急需能够最大程度上提高病毒基因传递效率以及修饰多种干细胞的方法来提高遗传疾病的疗效。

美国蓝鸟公司等机构也在尝试应用慢病毒载体携带正常ABCD1基因针对17例儿童ALD进行基因治疗的临床试验，现在正在处于数据收集阶段，结果目前显示患者在两年内对治疗有一定的应答效果，但是总体上效果仍旧较微弱，且有一例患者失去了行动及说话的能力，其他情况仍在跟踪观察中，因此ALD疾病的基因治疗目前正处在起步阶段。

发明内容

本发明方案的方法主要为应用改良优化后的慢病毒载体在EF1α启动子下携带ABCD1基因转染患者自身造血干细胞(HSCs)经回输后实现对ALD的基因治疗，其中根据实际情况可以结合脑内直接注射携带ABCD1基因慢病毒载体方式进行。其中具体的载体蛋白组成成分、包装细胞以及纯化方式的优化与改良均为定向设计的，其他任何应用相同的该改良后系统均应视为侵权，包括改变启动子(如应用CMV等替代EF1α实现基因表达等)、缩短ABCD1蛋白长度(如只应用功能域部分序列等)以及在本系统的基础上于慢病毒载体上添加任何无意义蛋白成分等。

本发明的一方面，公开了含重组质粒的慢病毒载体及其制备方法。本发明主要针对ABCD1 基因表达进行了慢病毒载体本身及包装纯化方法的优化，并且使用多种干细胞作为传送载体，使该基因在已分化或未分化的干细胞中表达效率更高，经过慢病毒载体优化后的ABCD1基因在转基因细胞中的表达量明显增加。此外，本发明采用的慢病毒载体为更新后的基因传递系统，在EF1α启动子的启动下，能够在保障安全性的同时实现更高效的基因传递。本发明中所使用的慢病毒载体是经过改良优化后的基因传递系统，与之前的其他系统相比，转染效率更高，稳定性更强，安全性更好，能够更高效的完成血友病基因治疗过程中正常基因的传递。而经该系统转导后能够成功实现HSCs及MSCs内ABCD1基因的稳定表达，充分证明了本发明对血友病基因治疗成功的可行性。