[发明专利]一种黄热病毒重组抗原的制备及其试剂盒制作方法

说明书

本发明涉及病毒检测领域，公开了一种黄热病毒重组抗原的制备方法，包括根据抗原性预测得分较高的病毒抗原表位片段设计引物，提取黄热病毒RNA，然后进行PCR扩增、构建原核表达载体和诱导表达重组质粒；还公开了一种黄热病毒重组抗原试剂盒的制作方法，黄热病毒重组抗原试剂盒包括PVC板、硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设有检测线和对照线，检测线上包被黄热病毒重组抗原，对照线上包被IgM抗体，以及辣根过氧化物酶标记的抗人μ链抗体和底物。本发明制备得到的黄热病毒重组抗原的特异性强，亲和力高，不会与其它虫媒传播病毒发生血清交叉学反应。

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，尤其涉及了一种黄热病毒重组抗原的制备及其试剂盒制作方法。

背景技术

黄热病毒(Yellow Fever Virus，YFV)属于黄病毒科的黄病毒属，病毒基因组为不分节段的单股正链RNA，有几个不同基因型，但是仅有一个血清型，抗原性保守。黄热病毒颗粒含有三种结构蛋白，大表面糖蛋白G，核外壳蛋白C，及表面蛋白M。黄热病是一种区域性疾病，在南美洲热带地区、撒哈拉以南的非洲发病率较高，主要通过埃及伊蚊(Aedesaegypti)的叮咬在灵长类动物或人之间传播。

黄热病毒感染的检测主要依靠核酸及血清学方法。血清学方法主要检测黄热病毒的特异性抗体，不仅可用于病原监测，还可用于监测机体的免疫反应过程，以及评价疫苗的接种效果。目前所用的黄热病毒感染的血清学检测方法，主要还是利用全病毒作为检测抗原的免疫荧光法，将体外培养的黄热病毒固定在玻片上，与样本血清共同孵育后，加入荧光素标记抗体，通过显微镜下观察荧光强弱进行阴阳性判断。该方法以天然病毒作为检测抗原，结果较为准确，但抗原片制备过程复杂，在抗原制备过程中还存在操作者被感染的风险。

而且，由于不同虫媒病毒之间存在严重的血清学交叉反应，在那些存在多种虫媒病毒流行的区域，患者因为混合感染导致体内存在交叉抗体，使得免疫学诊断及鉴别诊断十分困难。同时，由于IgG抗体可以在宿主体内存在很长时间，有的超过10个月，甚至终生携带，使得鉴别过去、最近还是现在感染也十分困难，对抗原的质量也提出了更高的要求。

因此，随着分子生物学技术的不断发展，获得纯度高、特异性强的基因工程重组抗原是重要的方向。此外采用Western-blot方法制成的试剂盒，一般常规实验室均可完成，不需要特殊设备，判读也简单明了。而现市售的Western-blot试剂均为进口试剂，价格昂贵。

发明内容

本发明针对现有技术中制备程序繁琐、试剂昂贵的缺点，提供了一种黄热病毒重组抗原的制备及其试剂盒制作方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

一种黄热病毒重组抗原的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，选取抗原片段

根据抗原性预测得分较高的病毒抗原表位片段设计引物，并在正向引物和反向引物5’端分别引入BamH I和Hind III酶切位点，正向引物：5’-TAGGAATTCTCAGCTTTGACACTCAAGGGGACATCC-3’，反向引物：5'-GACAAGCTTCTATTACTTTCCTATTGAGCTTCCCT-3’；

步骤二，黄热病毒RNA的提取

黄热病毒17D株经BHK-21细胞培养3d后，收集培养物的上清液，4℃条件下，10000g离心10min，收集沉淀物，加入5-10倍体积Trizol液，混匀后，4℃条件下静置5min，然后加入氯仿，摇荡15s，取第一上层水相加入水饱和酚，摇荡20s，取第二上层水相加入异丙醇，4℃条件下放置10min，4℃条件下，12000g离心10min后，取第一次沉淀，加入75％乙醇，4℃条件下，8000g离心5min，再取第二次沉淀加入75％乙醇，4℃条件下，8000g离心5min，得到黄热病毒RNA，室温下干燥6min后，将黄热病毒RNA溶于水中；