[发明专利]一种异枝江蓠原生质体的制备方法

说明书

本发明公开了一种异枝江蓠原生质体的制备方法，具体步骤为：(1)材料的预处理；(2)配制消化用酶液；(3)将步骤(1)中得到的材料加入步骤(2)配制好的消化用酶液中，放入25‑30℃的恒温摇床上进行黑暗酶解，反应2‑3h后，得到酶解液；(4)将步骤(3)中得到的酶解液用含有1mol/L的葡萄糖的消毒海水进行冲洗离心，制得异枝江蓠原生质体。本发明提供的异枝江蓠原生质体的制备方法简单，原生质体生产效率高，用本发明自制的消化用酶液酶解异枝江蓠可获得较高密度的原生质体，每克材料可获得7.7×10⁴个原生质体，为市售酶酶解效率的7‑8倍。

技术领域

本领域涉及藻类细胞工程学技术领域，尤其是涉及一种异枝江蓠原生质体的制备方法。

背景技术

异枝江蓠(Gracilaria bailiniae)为红藻门藻类江蓠科江蓠属的一种，在中国主要分布在广东省和海南省沿海，属热带大型海藻藻类，具有生长快、耐高温的特点，是南方沿海潜在的经济养殖品种之一。自然界和当前生产中，江蓠主要通过放散孢子的方式进行繁殖，但是传统的采苗方法耗时长，苗种培育受杂藻的污染影响较大，很难在室内保存，而且容易发生病害。原生质体的分离和培养技术可以有效地避免这些问题。此外，原生质体没有细胞壁，可用于诱导植株再生、种间细胞杂交、遗传工程研究等领域。目前，海藻酶解所用酶液一般为动物酶或微生物源酶，众多的研究表明，不同来源的酶对同一种海藻酶解效果不同，同一种酶对不同种的海藻媒介效果也不同，本发明自制的酶粉在适宜的条件下处理可以获得大量异枝江蓠的原生质体，且具有较高的效率。目前，缺乏一种酶解效率高的异枝江蓠原生质体的制备方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种酶解效率高的异枝江蓠原生质体的制备方法。

解释说明：本发明所述的″I₂-IK溶液″为碘-碘化钾溶液。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：本发明的一种异枝江蓠原生质体的制备方法，包括如下步骤：

(1)首先，挑选幼嫩且活力旺盛的藻体，清洗干净后用0.5g/L I₂-IK溶液浸泡10s，后用大量的消毒海水进行冲洗，并放入消毒海水中暂养后，取出藻体，吸水纸将藻体上水分吸干后用解剖刀将藻体切碎，得到材料；

(2)配制消化用酶液；

(3)将步骤(1)中得到的材料加入步骤(2)配制好的消化用酶液中，所述材料与消化用酶液的质量体积比为1g/10mL，放入25-30℃的恒温摇床上进行黑暗酶解，每30min镜检一次，观察并拍照，反应2-3h后，得到酶解液；(4)用筛绢对步骤(3)中得到的酶解液进行过滤，去除未消化的细胞、细胞团和碎片，取上清液进行离心处理，使单细胞原生质体下沉，细胞碎片留在上清液中，弃去上清液，用含有1mol/L的葡萄糖的消毒海水进行冲洗离心2-3次，收集沉淀后用含有1mol/L的葡萄糖的消毒海水悬浮至1mL，制得异枝江蓠原生质体。

上述步骤(1)中所述的暂养温度为24℃，光照强度为3000lx，暂养时间为1-2天。

上述步骤(2)中所述的消化用酶液为：自制纤维素酶与消毒海水的混合液，每10mL消化用酶液由1.5mL的自制纤维素酶和8.5mL的消毒海水组成；所述的自制纤维素酶的制备方法为：配制50mmol/L醋酸缓冲液并调整pH为4.8-5.0，分别按1g/10mL的量加入纤维素酶，充分溶解，并调整自制纤维素酶的最终浓度为2％，即得自制纤维素酶。

上述步骤(3)中所述的材料与消化用酶液的质量体积比为1g/10mL，表示每10mL制备好的消化用酶液加入1.0g材料。

上述步骤(4)中所使用的筛绢目数为200目。

上述步骤(4)中所述的离心的速度为800rpm，离心的时间为10min。