[发明专利]粪便宿主DNA甲基化检测方法

说明书

本发明提出了提取粪便中宿主DNA的试剂组合物及利用其提取粪便中宿主DNA的方法、DNA甲基化的方法和对经过甲基化的粪便宿主DNA进行甲基化特异性PCR检测的试剂盒及方法。所述试剂组合物包括：提供硫酸根离子的裂解液A；以及提供钙离子的絮凝剂。利用本发明的试剂组合物能够充分提取出粪便中的宿主DNA，且提取效率较好、宿主DNA纯度较高，操作简便，适于规模化应用。

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及粪便宿主DNA甲基化检测方法。更具体地，本发明涉及提取粪便中宿主DNA的试剂组合物及利用其提取粪便中宿主DNA的方法、DNA甲基化的方法和对经过甲基化的粪便宿主DNA进行甲基化特异性PCR检测的试剂盒及方法。

背景技术

DNA甲基化(DNA methylation)是最早发现的修饰途径之一，是表观遗传修饰的重要组成部分。DNA甲基化一般发生在CpG位点，而DNA基因启动子区域CpG岛与基因表达密切相关。由此，甲基化水平的检测对于研究宿主的特定基因表达情况具有重要意义。于人类而言，DNA甲基化与癌症关系巨大，一些基因的甲基化检测已被广泛用于癌症的早期诊断中，如乳腺癌(p16ink4a、RARβ)、肺癌(p16、DAPK、APC)、卵巢癌(TUSC3)等。

粪便作为一种新的非损伤性来源的样本，在动物分子遗传学、种群生态学和一些肠道疾病诊断等领域广泛应用。粪便中含有许多具有遗传信息的样品，如肠道菌群DNA、食物残渣样品DNA、消化道脱落细胞DNA等。

然而，目前对粪便宿主DNA的检测仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

脱落细胞是宿主遗传变异信息分析的优良载体，但由于其含量较低且粪便样本中干扰物质种类和含量较多，如多聚糖、胆盐、胆酸、色素和粘液等，虽有很多商业化的试剂盒，但大多数只能进行宏量肠道菌群DNA提取，对宿主细胞DNA效率极低，难以满足后续分析，并且由于粪便宿主DNA样本中干扰物质通常难以完全去除，为微量宿主DNA基因甲基化的检测进一步增加了难度。

有鉴于此，发明人通过对提取粪便宿主DNA的试剂进行优化，尤其是絮凝剂的添加，从而有效去除粪便宿主DNA中杂质、PCR抑制物等，提高粪便宿主DNA的提取效率。在甲基化过程中，通过添加λDNA作为转化辅助因子，显著降低甲基化过程中DNA损失，并显著提高对于转化后微量目标基因片段的回收率。通过对甲基化的宿主DNA中目标片段进行扩增，以实现检测目的。在扩增过程中，选择较佳的扩增试剂及扩增程序，从而提高扩增效率，进一步提高检测准确性和灵敏度。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种提取粪便中宿主DNA的试剂组合物。根据本发明的实施例，所述试剂组合物包括：提供硫酸根离子的裂解液A；以及提供钙离子的絮凝剂。

由于粪便样本中宿主细胞DNA含量较少，且干扰物质种类及含量较多，如多聚糖、胆盐、胆酸、色素和粘液等，会导致DNA提取效果较差，且杂质较多。进而，发明人创造性地构建絮凝体系，以去除粪便样本中的干扰物质。具体地，在裂解液A中提供硫酸根离子，其可以与后续加入的含有钙离子的絮凝剂发生硫酸钙沉淀反应形成絮状沉淀，同时可以沉淀多种颗粒物等干扰物，从而提高粪便宿主DNA的提取效率及纯度。并且，利用该试剂组合物提取的操作简便，适于规模化应用。

根据本发明的实施例，上述提取粪便中宿主DNA的试剂组合物还可以进一步具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述裂解液A中含有硫酸铵，所述絮凝剂为氯化钙溶液。由此，通过构建絮凝体系，沉淀多种颗粒物等干扰物质，进一步提高粪便宿主DNA的提取效率，且不影响后续DNA甲基化及PCR扩增反应的发生。