[发明专利]一种靶向胰腺癌循环肿瘤细胞的纳米荧光探针

说明书

本发明提供一种靶向胰腺癌循环肿瘤细胞的纳米荧光探针，所述探针包括H₂O₂响应性的荧光小分子和靶向胰腺癌表面标记物的聚合物，所述H₂O₂响应性的荧光小分子和靶向胰腺癌表面标记物的聚合物具有相反的亲疏水性。本发明通过透明质酸和胰腺癌肿瘤表面高表达的CD44抗原特异性结合，HA‑NP‑BE纳米荧光探针可以靶向性地进入胰腺癌细胞，检测细胞内的H₂O₂并对其成像，且具有快速的响应性，可以有效地区分胰腺癌肿瘤细胞和正常细胞，检测出胰腺癌肿瘤病人中的CTC，有助于胰腺癌的早期诊断。

技术领域

本发明属于生物领域，更具体地讲，涉及一种靶向胰腺癌循环肿瘤细胞的细胞内过氧化氢的“比率型”纳米荧光探针。

背景技术

目前循环肿瘤细胞(CTCs)检测主要包括富集和鉴定二部分。由于CTCs具有量少、异质性和变形性等特点，目前有许多方法可用于CTCs的检测。富集方法有根据细胞密度、大小、介电性等特性的物理学方法，根据细胞表面特异性抗原包括上皮粘附分子(EpCAM)、EGFR的免疫学方法和去红细胞、白细胞的负筛选方法；鉴定方法有流式细胞术、免疫荧光法、荧光原位杂交、反转录PCR和二代测序。其中负筛选和免疫荧光法的方法最常用或有效。

细胞内过氧化氢是细胞的“第二信使”，与细胞的生长、分化、迁移和凋亡有关。细胞内过氧化氢浓度的增高可以使细胞内DNA受损，引起细胞癌变。已有的研究表明，循环肿瘤细胞中过氧化氢浓度明显增高。

中国发明专利CN201710564408.5公开了一种过氧化氢响应的比率计纳米探针及其应用，虽然有不受H₂O₂浓度影响的内标荧光分子罗丹明B作为参照，但罗丹明B和香豆素的激发波长不一样，在激光共聚焦显微镜中的激光的功率很难保持一致，两种荧光的发射效率也不一样，体外的H₂O₂浓度标准曲线在应用于细胞内的H₂O₂检测时，细胞环境和检测设备的干扰因素太多，只能半定量检测。

透明质酸可以特异性地靶向肿瘤细胞表面高表达的CD44。CD44是黏附因子家族中的一员，是介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间黏附作用的膜表面糖蛋白，参与细胞的增殖、分化、黏附、迁移。CD44主要参与异质性粘附，即肿瘤细胞与宿主细胞和宿主基质的粘附，异质性粘附在肿瘤细胞侵袭转移中起促进作用。

目前使用的循环肿瘤细胞的富集方法和鉴定方法均有局限性，结果不令人满意。尽管在正常人的外周血液中未能发现上皮细胞，但胰腺的良性疾病和恶性肿瘤病人外周血中均能发现上皮细胞，且细胞形态，包括细胞大小、核大小、核形态、细胞质/核比例等均无明显差别，因此基于物理方法的富集和鉴定方法不能用于胰腺癌的循环肿瘤细胞的检测。另一方面，用于胰腺癌诊断、疗效监测和术后生存率预测最常用的肿瘤标志物只有糖类抗原(CA19-9)和癌胚抗原(CEA)。但这两种肿瘤标志物都存在一个很大的问题--特异性不高。Lewis a和b-基因型血型的患者无法合成CA19-9。此外，在非恶性疾病如肝硬化、糖尿病、慢性胰腺炎、胆管炎、梗阻性黄疸以及其他消化道癌症患者中，CA19-9也有可能高表达。即使在可切除的胰腺癌患者中，高达35％的患者CA19-9也不高表达。同时，由于胰腺癌的肿瘤细胞存在异质性，在细胞的上皮-间质转换过程中(EMT)，EpCAM和CK19这些上皮标志物表达极有可能降低。因此，应用EpCAM和CK19抗体分别捕获富集和鉴别CTCs存在局限性，在捕获胰腺癌的CTCs运用中结果令人失望。

因此，亟需提供一种靶向胰腺癌循环肿瘤细胞的纳米荧光探针，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种不依赖于细胞表面EpCAM和CK19抗原的表达，靶向肿瘤细胞表面的CD44，提高纳米荧光探针的检测效率，降低白细胞的干扰，降低胰腺癌肿瘤细胞检测中的假阴性结果和假阳性结果，具有良好生物相容性的靶向胰腺癌循环肿瘤细胞的纳米荧光探针。