[发明专利]富集捕获粪便中低丰度目标核酸的方法

说明书

本发明公开了一种富集捕获粪便中低丰度目标核酸的方法，属于生物技术领域。首先采用传统的柱式离心管吸附提取法获得粪便样品人基因组DNA，然后设计特异性探针对粪便中的目标基因片段进行扩增；探针的5’端上标记有生物素，能与磁珠上的亲和素进行结合；最后在磁力环境下进行洗脱，从而将目标片段富集捕获下来。本发明采用目标基因片段PCR扩增和靶向捕获相结合的办法，能显著提高粪便中低丰度目标片段的得率和产量，从而有效减少因目标片段提取效率低而引起的检测结果假阴性，特别适用于通过检测粪便DNA开展结直肠癌无创早期诊断和靶向治疗肿瘤基因状态监测等。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种富集捕获粪便中低丰度目标核酸的方法。

背景技术

美国2016年结直肠癌指南将粪便DNA检测列为肠癌筛查的7种办法之一，与常规结肠镜检查和大便隐血实验相比，粪便DNA检测具有特异性好、灵敏度高和易于被患者接受等优势，有着广阔的应用前景。此外，近年来的研究发现，部分RAS野生型肠癌患者在抗KEGF单抗治疗过程中会出现耐药突变，导致治疗失败。因此，专家建议对行抗KEGF单抗治疗的患者，应持续监测肿瘤基因状态。传统的肿瘤组织基因检测是一种侵入性、有创性的检查，且不便于根据患者的病情需求进行实时的肿瘤基因状态监测。而粪便DNA检测为此提供了一条无创、便捷的的肿瘤基因监测途径，将为精准治疗的开展提供巨大帮助。

采用高效的提取方法，从粪便中获得大量且高质量的人基因组DNA，是通过检测粪便DNA开展结直肠癌无创早期诊断和靶向治疗肿瘤基因状态监测等临床应用的关键。但粪便中目标基因(如肿瘤细胞来源的DNA)量所占的比例极少，且由于粪便中含有大量消化残留物和微生物，DNA非常容易被降解。酚抽提/沉淀法、柱式离心管吸附提取法等传统核酸提取方法往往难以富集到足量的目标基因来用于下游检测，进而造成检测结果的假阴性。

中国专利CN106967712A公开了一种粪便DNA快速提取试剂盒，其原理主要为：首先将粪便样品中的核酸裂解释放出来，再让释放出来的核酸特异性地结合到绑定了特异性探针的磁珠上，最后将核酸从磁珠上洗脱下来。该试剂盒提取的核酸比传统的核酸提取方法具有更高的纯度，但仍有不足之处：当粪便中目标基因片段量极少时，用该方法捕获到的目标片段量可能仍低于下游检测方法的检测下限。因此，有必要提出一种新的富集捕获粪便中低丰度目标核酸的方法，从而可以建立一种通过快速、准确检测粪便DNA开展肠癌无创早期诊断和指导临床靶向用药等的流程方案。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明提供了一种富集捕获粪便中低丰度目标核酸的方法，具体地，包括以下操作步骤：

1.粪便样品收集及预处理：采用新型粪便采集处理器发明专利(在先中国专利申请号：201711119197.0)中所述装置及方法，对粪便样品进行收集及预处理。

2.基因组DNA抽提：对所述步骤1中的粪便样品的人基因组DNA进行抽提。优选采用柱式离心管吸附提取法。

3.设计和制备探针：根据目标基因突变位点所在区段设计探针，同时选择目标基因相对保守的区段作为样品外参，外参对目标基因量起着质控的作用。在探针的5’端上标记生物素。

4.扩增目标基因片段：以所述步骤2中获得的粪便样品DNA作为模板，用所述步骤3中设计的探针，对目标基因片段进行PCR扩增，以提高后续目标片段捕获量。优选采用多重PCR，可一次性同时扩增多个目标基因片段。根据模板量设置PCR反应循环数，优选1～10个循环。

5.捕获目标基因片段：所述步骤4中的目标基因片段PCR扩增产物的5’端上标记有生物素，能与磁珠上共价耦合的亲和素进行特异性结合。在磁力环境下进行洗脱，目标基因片段由于与磁珠绑定得以保留，非目标基因片段和其他杂质(如蛋白)则被去除。

6.荧光定量PCR检测：通过荧光定量PCR对所述步骤5中捕获的目标基因片段进行检测。优选采用竞争性等位基因特异性PCR。