[发明专利]一种人诱导多能干细胞的制备方法

说明书

一种人乳齿细胞诱导重编程的方法，包括：(1)分离乳齿细胞；(2)培养乳齿细胞；(3)向乳齿细胞中转入Oct4、Sox2、c‑Myc和Klf4四种因子；(3)转入端粒酶RNA，瞬时表达端粒酶；(5)多能性鉴定。所述方法将儿童换牙期脱落的乳齿充分利用制备多能干细胞，另外，使用端粒酶RNA在延长细胞的端粒长度的同时确保了安全性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是干细胞工程领域。具体涉及一种人诱导多能干细胞的制备方法。

背景技术

干细胞不但可以产生或分泌大量的生物活性因子，而且干细胞内也含有丰富的生物活性物质，这些干细胞生物活性因子或物质可有效调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞等。例如干细胞可以产生干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、基质细胞源性生长因子(SDF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、白介素-6与白介素-7(IL-6与IL-7)、巨核细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等因子，这些细胞因子具有促进细胞增殖、分化、抗凋亡等功能；干细胞还可以产生天然免疫蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等，可以抵御或修复自身和外界因素对机体细胞造成的损伤。因此，利用干细胞分泌产生的生物活性因子或干细胞内的生物活性物质激活机体干细胞，进而通过自身干细胞生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞，在疾病防治与保健美容领域具有广阔的应用前景。

2006年，日本京都大学Yamanaka(山中伸弥)教授所率领的研究小组筛选出了4个在胚胎干细胞或肿瘤细胞中高表达的基因转录因子(Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc)，并利用逆转录病毒载体将这些因子转染到小鼠成纤维细胞中。通过这些因子在受体细胞内过量表达，诱导成纤维细胞去分化，使成体细胞重编程为多能干细胞，并将其定义为诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，i PS)。诱导多能干细胞功能几乎和胚胎干细胞一样，表达胚胎干细胞的各种表面标记，可以分化为各种组织细胞，不受免疫排斥和伦理学等限制，在组织工程及修复方面显示出了独一无二的优势。

人类牙齿拥有两套系统，掉了乳牙才替换为恒牙，人体别的器官都从一而终，脱落的乳牙中包含着丰富的细胞资源。即使医学和生物学高度发达的今天，脱落的乳牙并没有充分利用，造成了极大的浪费。近几年，有报道尝试从脱落的乳牙中分离干细胞(如牙髓干细胞(DPSC)、牙周韧带干细胞(PDLSC)和根尖乳头干细胞(SCAP))，为后续进一步诱导分化产生牙齿提供了可行性。

端粒酶能以自身RNA为模板，合成端粒重复序列加至新合成的RNA链末端，从而防止染色体末端丢失及解决末端复制难题。在端粒酶的3个亚基中，TERT是端粒酶活性的催化亚基。由于正常体细胞中几乎无TERT表达，因而这些细胞无端粒酶活性，细胞随有丝分裂不断缩短，最后衰老死亡。虽然端粒酶适量表达可延长细胞寿命，但过量表达又是肿瘤细胞无限增殖的重要原因之一。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种能够充分利用人类脱落的乳齿制备诱导多能干细胞的方法。本发明所述方法，尽可能提取了乳齿中全部细胞成分，对其进行充分利用。另外，本发明通过转入端粒酶RNA的方式瞬时表达端粒酶，延长细胞寿命。

具体而言，本发明提供了1、一种人乳齿细胞诱导重编程的方法，包括：

(1)分离乳齿细胞；

(2)培养乳齿细胞

(3)向乳齿细胞中转入编码Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种因子的载体；

(4)转入端粒酶RNA，瞬时表达端粒酶；

(5)多能性鉴定。