[发明专利]一种重组解脂耶氏酵母脂肪酶及其表达菌株与应用

说明书

本发明公开了一种重组解脂耶氏酵母脂肪酶及其表达菌株与应用，表达菌株的制备方法为：将脂肪酶基因连接至表达载体上，获得重组质粒；所述脂肪酶基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；将重组质粒转化入枯草芽孢杆菌中，挑选阳性克隆，获得重组解脂耶氏酵母脂肪酶表达菌株。将表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制备重组解脂耶氏酵母脂肪酶，16小时培养后的活力达到为109.3U/mL。实现了饲料用脂肪酶的安全、稳定生产，在食品、能源、化工和医药等行业具有重要应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术与饲料行业领域，具体涉及一种重组解脂耶氏酵母脂肪酶及其表达菌株与应用。

背景技术

脂肪酶(lipase)是一类典型的羧酸水解酶，因能催化水解、酯化、转酯化等多种反应类型而广泛应用于食品、医药、能源、环境等领域，但脂肪酶在饲料方面的应用开发相对其它饲用酶仍处于起步阶段。以解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2为代表的饲用脂肪酶具有耐受肠胃环境、生物安全性好、pH及温度性能优越等诸多饲用酶所需特点，具有很高的开发应用潜力。

饲用脂肪酶通过酶促生化反应，强化饲养动物的脂肪消化利用过程，在确保消化道酸性环境品质稳定的前提下，改善饲料中油脂消化吸收的限速步骤，解决高能营养物油脂的消化利用效率。其具体作用体现于：(1)外源性脂肪酶的添加有利于补充幼畜因消化机能发育不全所造成的内源性消化酶活性和分泌量的不足。成年动物的消化系统则因油脂消化利用更加有效而获得减负；(2)通过生态地改善动物的消化吸收环境，既能提高饲养动物肉类品质，也能有效降低因油脂消化利用问题诱发多种疾病的发生概率。例如：添加脂肪酶可以减少动物因高脂肪消化不良而造成的营养性腹泻，促进动物生长；(3)脂肪酶的加入可以减少油脂的添加量，节省配方空间，降低饲料成本；(4)脂肪酶添加使饲料原料的能量利用率最大化，减少集约化养殖中营养物质的排泄，对打造绿色生态养殖业具有重要意义。

枯草芽孢杆菌是需氧，易于培养，生长周期较短，广泛存在于自然界中，无细胞毒性，易于分离纯化，转录翻译十分严格，不易产生错误，微生物研究中较为理想的模式菌株。枯草芽孢杆菌具有安全、无致病性等特性，被美国食品监督委员会成为GRAS(GenerallyRecognized as Safe)，又是益生菌。其次枯草芽孢菌细胞膜为单层，分泌的蛋白容易回收、纯化。，操作简单，并且能够产生多种酶类分泌到细胞外；此外，枯草芽孢杆菌易于培养，对培养基成分要求不严格，克采用相对低廉培养基成分，有效的降低生产成本，质粒、噬菌体都可作为克隆载体，没有明显的密码子偏好性，转录翻译系统十分严密，可以避免错误折叠的蛋白质和包涵体，因而在发酵领域有较好的应用前景。

现有的技术可利用生物载体进行脂肪酶的生产，如闫金勇等利用毕赤酵母表达生产脂肪酶，如徐莉等利用转化解脂耶氏酵母生产脂肪酶，然后发酵时间过长(大于72小时)，生产周期偏长。

发明内容

针对现有的技术的以上缺陷和改进需求，本发明提供一种重组解脂耶氏酵母脂肪酶及其表达菌株，以实现减短饲料用脂肪酶的生产周期，降低生产的成本。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种重组解脂耶氏酵母脂肪酶表达菌株，由下述方法制得：

(1)将脂肪酶基因连接至表达载体上，获得重组质粒；所述脂肪酶基因具有如SEQID NO:1所示的核苷酸序列；

(2)将重组质粒转化入枯草芽孢杆菌中，挑选阳性克隆，获得重组解脂耶氏酵母脂肪酶表达菌株。

进一步地，所述载体为pHT43。所述枯草芽孢杆菌为WB800N。

第二方面，本发明提供了一种重组解脂耶氏酵母脂肪酶，以表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制备脂肪酶。