[发明专利]一种抗枯萎病香蕉种质的筛选方法

说明书

本发明属于香蕉愈伤组织辐射诱变育种领域，具体涉及一种抗枯萎病香蕉种质的筛选方法。选取香蕉未成熟雄花愈伤组织为辐射突变材料，采用含有不同浓度镰刀菌FOR4粗毒素培养基进行香蕉未成熟雄花愈伤组织粗毒素筛选、分化芽粗毒素筛选、香蕉生根苗粗毒素筛选等，采用三次毒素胁迫筛选技术，增强了筛选压力，提高了抗枯萎病突变种质的筛选效率，缩短了培育香蕉抗枯萎病种质筛选时间，提高抗病育种的效率。

技术领域

本发明属于香蕉愈伤组织辐射诱变育种领域，具体涉及一种抗枯萎病香蕉种质的筛选方法。

背景技术

香蕉是典型的热带亚热带果树,广泛分布于热带和南亚热带地区。我国是世界香蕉主产国之一，种植区域分布于广东、海南、广西、福建、云南及台湾等省区，栽培面积和产量居全国水果的第四位。然而，香蕉产业迅猛发展的同时，正遭遇有史以来枯萎病最严重的威胁和挑战。

香蕉枯萎病，又称巴拿马病、黄叶病，是由尖镰孢古巴专化型[Fusariumoxysporumf.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder et Hasen，Foc]侵染引起的土传维管束系统性的病害，侵染来源主要是带菌的吸芽、病株残体及带菌土壤，一旦发病就会全株死亡，病菌蔓延快，很难根治。本世纪以来，广东、海南、福建等地的香蕉栽培面积却因巴拿马枯萎病的泛滥大幅度减小。据不完全统计，广东、海南等地的主要香蕉产区香蕉枯萎病的影响面积达18万公顷。与2010年相比，2013年海南的香蕉栽培面积几乎减少50％，云南和广西香蕉也开始大面积突发黄叶病。与香蕉产业遭受严重枯萎病危害相对应的，是对香蕉枯萎病发病机制的研究有限，世界范围内还无抗枯萎病的新品种和有效防治措施。因此，培育抗香蕉枯萎病的新品种是遏制枯萎病蔓延，促进香蕉产业健康可持续发展的根本途径。由于目前栽培的香蕉大部分是三倍体，单性结实,具有高度的不育性，无法通过常规杂交选育抗枯萎病新品种，因此利用60Co-γ射线辐射诱变香蕉，培育香蕉突变体，从突变体中筛选具有抗枯萎病突变的新种质，再培育获得新品种是香蕉抗枯萎病育种的重要途径之一。

目前国内外对香蕉辐射诱变进行抗枯萎病育种研究报道文献较少，在辐射诱变材料的选择上主要采用香蕉吸芽、香蕉组培芽或者香蕉幼苗，其方法主要缺点在于需要处理的突变材料多，筛选周期长、效率低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种抗枯萎病香蕉种质的筛选方法，选取香蕉未成熟雄花愈伤组织为辐射突变材料，采用愈伤组织镰刀菌粗毒素筛选、分化芽粗毒素筛选、香蕉生根苗粗毒素筛选的三次镰刀菌粗毒素筛选技术，提高了抗枯萎病突变种质的筛选效率，缩短了培育香蕉抗枯萎病品种的周期。

本发明的第一个方面是提供一种抗枯萎病香蕉种质的筛选方法，包括以下步骤：

(1)粗毒素制备

将Foc4菌种接种至培养基中培养，分离得到香蕉枯萎病菌粗毒素(下文简称“粗毒素”)；

(2)香蕉未成熟雄花愈伤组织的辐射处理

对香蕉未成熟雄花愈伤组织进行辐射处理，然后置于人工气候箱进行黑暗培养，使辐射后的愈伤组织恢复生长；

(3)香蕉未成熟雄花愈伤组织粗毒素筛选

将恢复生长的辐射后的愈伤组织转至光照培养箱中培养12-18天后，转移到含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的生长培养基中培养28-32天；

选择成活的愈伤组织转移至愈伤组织继代培养基中进行继代培养28-32天，定期更换培养基；

然后将愈伤组织接种于分化固体培养基上，诱导愈伤组织分化出芽；

(4)分化芽粗毒素筛选

分化培养的幼芽长至约0.5cm时，将幼芽转移至含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的分化培养基上培养；

(5)香蕉生根苗粗毒素筛选