[发明专利]一种新普鲁兰酶与其编码基因和应用

说明书

本发明涉及一种新普鲁兰酶蛋白及其编码基因，以及该蛋白作为淀粉、普鲁兰糖水解酶在工业领域的应用。本发明以深海沉积物样品宏基因组文库为研究材料，对宏基因组文库进行测序和基因功能注释分析，根据注释信息筛选得到一条新普鲁兰酶基因，根据基因序列信息设计引物，以宏基因组为模板，进行PRC扩增，得到编码新普鲁兰酶的基因序列，其DNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示。将目的基因插入pCold表达载体中，表达纯化得到该基因编码的多肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2序列所示。本发明的新普鲁兰酶，由于其特有的活性及酶学特性，可应用于与普鲁兰糖、可溶性淀粉、直链淀粉水解相关的工业化生产中。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种新普鲁兰酶与其编码基因及其应用。

背景技术

新普鲁兰酶是最具代表性的一类多功能淀粉酶，在淀粉生产糖的过程中，加入新普鲁兰酶作为辅助酶，可提高糖的转化率，还可以使用新普鲁兰酶来代替其他的转糖苷酶，以淀粉为原料生产低聚异麦芽糖、低聚麦芽糖等益生元。目前的淀粉酶和新普鲁兰酶产量较低，难以满足目前市场的要求，因此，开发新型的新普鲁兰酶在淀粉加工业、食品、农业与医药行业中有着重要的研究价值及应用前景。

海洋具有丰富的生物多样性，尤其是深海微生物所特有的适应各种极端环境的酶系是丰富的新酶资源。但是海洋微生物特别是深海微生物取样困难，培养条件特殊，能够分离培养的微生物更少，近年来宏基因组学技术体系的建立使从不可培养微生物样品中直接获得酶资源成为可能。

宏基因组学通过提取环境中微生物基因组DNA，构建相应的宏基因组文库，并对宏基因组进行筛选和分析，来寻找和发现新的功能基因。这种不依赖于环境中微生物的分离和培养的技术拓展了微生物学的研究思路与方法，为从不同自然环境中的为培养微生物中寻找新的基因资源和活性物质提供了有力的技术手段，也为研究和开发深海微生物资源提供新的方法和思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于深海沉积物样品的新普鲁兰酶基因、及其所编码的新普鲁兰酶在工业化生产中的应用。

其一，本发明涉及一种新普鲁兰酶，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

进一步地，本发明还涉及编码上述的新普鲁兰酶的基因，其核苷酸序列具体为序列表SEQ ID NO.1所示。

进一步地，用于所述的核苷酸序列特异性扩增的引物，包括以下两条序列：

上游引物见序列表中SEQ ID No.3；

下游引物见序列表中SEQ ID No.4。

进一步地，本发明还包括一种表达载体，所述的表达载体含有上述核苷酸片段。

进一步地，所述的表达载体，其具体为pCold-Neopullu31369。

进一步地，本发明还包括一种表达工程菌，其携带有上所述的表达载体。

进一步地，所述的表达工程菌，其具体为转化的大肠杆菌菌株BL21(DE3)。

本发明所述的新普鲁兰酶，为从深海沉积物样品宏基因组文库中筛选并克隆得到的，所述新普鲁兰酶基因获得方法为：通过从深海沉积物样品的宏基因组文库测序数据中获取了含新普鲁兰酶序列片段，通过对这些宏基因组序列信息设计引物，以宏基因组文库为模板进行PCR扩增，最后克隆得到新普鲁兰酶编码基因。

本发明对新普鲁兰酶Neopullu31369氨基酸序列进行生物信息学分析，该酶全长由588个氨基酸组成，其DNA和氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；序列分析显示该酶含有一个AmyAc_CMD结构域，N端含有E_set_CDase结构域，C端含有Malt_amylase_C结构域。