[发明专利]一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价方法

权利要求书

1.一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价和活力测定方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）铬鞣皮粉底物的制备

将由动物皮中间网状层制取的皮粉分散在浓度为0.05-0.10g/mL的NaCl溶液中，形成皮粉浓度为0.05-0.20g/mL的悬浮液，于20-50°C下振荡1-24小时，使皮粉充分吸水后，用适量酸溶液调整浴液pH至2.0-4.0，然后每质量份皮粉加入0.05-0.60质量份的铬鞣剂，于20-45°C振荡使铬鞣剂与皮粉中的胶原纤维充分接触，再加入适量提碱剂调整浴液pH至3.5-4.5使铬鞣剂与胶原纤维发生结合；于20-50°C静置1-5天，之后经过滤所得皮粉用水洗涤至洗出液呈无色，洗涤后的皮粉再经过脱水、干燥、粉碎、过20-200目筛，制得铬鞣皮粉底物；

所述的铬鞣剂包括：碱式硫酸铬，所述的铬鞣剂是碱度10%-40%的固体或者液体铬鞣剂；

（2）制备待测反应液和空白对照液

向50-200 mg铬鞣皮粉中加入1-20 mL缓冲液，混匀，加热至测定温度，加入将蛋白酶用对应pH的缓冲液溶解并稀释N ₁ 倍形成的蛋白酶溶液0.1-5.0 mL，在振荡下于测定温度进行酶解反应T小时，控制酶解反应的时间使铬鞣皮粉不被完全消耗，酶解反应后立即离心，并取1 mL上清液加入12mol/L的盐酸1 mL于100-140°C条件下消解6-48小时，消解液经去离子水稀释N₂倍即为待测反应液；

向50-200 mg铬鞣皮粉中加入1-20 mL缓冲液，混匀，加热至测定温度，加入对应pH的缓冲液0.1-5.0 mL，于测定温度振荡T小时，立即离心，取1 mL上清液加入12mol/L的盐酸1 mL于100-140°C条件下水解6-48小时，消解液经去离子水稀释N ₂ 倍即为空白对照液；

缓冲液的pH值为2-9；

所述缓冲液为伯瑞坦-罗宾森缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液或者Tris-HCl缓冲液中的至少一种；

所述的蛋白酶为酸性蛋白酶、中性蛋白酶或者碱性蛋白酶；

（3）消解液中的羟脯氨酸浓度测定及酶活力计算：分别测定空白对照液和待测反应液的盐酸消解液中的羟脯氨酸浓度，记为H ₀ 和H，根据式（1）计算蛋白酶对铬鞣胶原纤维的水解活力

（1）

式（1）中， H ₀ 和 H 分别为空白对照液和待测反应液的盐酸消解液中的羟脯氨酸浓度，μg/mL； N ₂ 为盐酸消解液的稀释倍数； V 为酶解反应体系的总体积，mL； T 为酶解反应的时间，h； N ₁ 为蛋白酶的稀释倍数；

所述的酸为甲酸、乙酸、硫酸、盐酸和芳香族磺酸中的至少一种；

所述的提碱剂为碳酸钠、碳酸氢钠、氧化镁或碳酸钙中的至少一种；

该方法适用于在皮革领域中表征蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的水解活力及蛋白酶对蓝湿革作用性能的评价。

2.根据权利要求1所述的一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价和活力测定方法，其特征在于所述羟脯氨酸浓度的测定方法是氯胺-T法、氨基酸分析仪法或HPLC法的至少一种。

3.根据权利要求1所述的一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价和活力测定方法，其特征在于所述测定的温度范围为10-65°C。