[发明专利]高效表达重组人神经生长因子的基因组合

说明书

本发明选择了优化的重组人神经生长因子的基因表达调控元件，提供了高效表达rhNGF的基因组合。该组合提高了rhNGF的表达水平，经实验证实，本发明提供的基因组合在真核表达系统中高效表达具有天然活性的重组人神经生长因子。

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种在真核表达系统中高效表达具有天然活性的重组人神经生长因子(rhNGF)的基因组合。

背景技术：

NGF具有神经元营养和促轴突生长双重生物学功能，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。

NGF在体内以前体形式(proNGF)合成，包括“基因B”、前导肽和成熟NGF。“基因B”有助于蛋白的分泌；前导肽中有两部分保守区域为proNGF表达、酶解形成具有生物活性的蛋白以及成熟NGF的分泌所必需，且其还有助于蛋白的正确折叠。proNGF包含潜在的N糖基化位点，proNGF中前导肽的糖基化有助于其出内质网。proNGF经弗林蛋白酶或激素酶原转化酶在特定部位水解后形成具有生物学活性的成熟NGF。成熟NGF有118个氨基酸，呈双链二聚体结构。单链内共有6个半胱氨酸残基，可对应形成3对链内二硫键(Cys⁵⁸-Cys¹⁰⁸，Cys⁶⁸-Cys¹¹⁰，Cys¹⁵-Cys⁸⁰)，二硫键的正确形成是NGF具有活性的必要条件。

我国是世界上第一个也是唯一一个批准注射用mNGF(鼠神经生长因子)上市的国家。mNGF与人神经生长因子(hNGF)在蛋白质氨基酸序列上有10％差异，作为异源蛋白质长期使用有潜在的安全性问题，且存在鼠源病毒污染风险。

20世纪90年代起，国外多家制药公司和研发机构相继开始研究重组人神经生长因子，但迄今尚未有开发成功的rhNGF产品上市。其主要原因是NGF表达水平低、表达产物生物学活性差以及hNGF与mNGF的同源性问题。

例如，意大利Dompé公司研发的rhNGF滴眼液于2017年7月6日获欧洲药品管理局批准用于中度至重度神经营养性角膜炎的治疗，其中的活性成分rhNGF采用大肠杆菌表达系统以proNGF形式进行表达，由于该系统缺乏有效的翻译后修饰功能，不利于成熟NGF蛋白的正确折叠，表达产物为包涵体，后续工艺需要体外复性、蛋白酶切除前导肽才能获得目标蛋白，导致生产工艺复杂、产物得率低、生产成本高等缺点。

在真核表达系统中高效表达rhNGF是目前需要解决的技术难题。因为高效表达载体是实现rhNGF高产率的主要因素。在表达载体构建过程中采用合适的表达调控序列和合理的结构排列，可以提高rhNGF的表达水平。

发明内容

本发明的目的是优化重组人神经生长因子的基因表达调控元件，提供高效表达rhNGF的基因组合。

本发明人发现，通过选择适当的调控元件与人神经生长因子前体基因(以下亦简称为proNGF基因)进行连接，可以显著提高在真核表达系统中rhNGF的表达水平。

本发明提供了一种高效表达rhNGF的基因组合，所述组合为：“基因B—基因A”；

所述基因A，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，称为proNGF基因，包含前导肽基因和成熟hNGF，编码SEQ ID No.8所示序列的氨基酸；

所述基因B，其核苷酸序列如SEQ ID No.3(简称Pre)，或SEQ ID No.5(简称Luc)所示，它们编码SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示序列的氨基酸。

本发明提供了第二种高效表达rhNGF的基因组合，还包括有基因C的元件，连接顺序为：“基因C—基因B—基因A”；