[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9技术敲除Endoglin基因的方法

说明书

本发明公开一种利用CRISPR/Cas9技术敲除Endoglin基因的方法，属于基因工程、免疫学和肿瘤学技术领域。所述方法含有针对Endoglin基因敲除的CRISPR/Cas9的gRNA序列；所述序列如SEQ ID NO:1序列；所述针对Endoglin基因敲除的CRISPR/Cas9的gRNA序列的设计选择在第一外显子。本发明进一步研究了Endoglin在恶性肿瘤细胞发生、发展及转移过程中不可或缺的作用，并探讨利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对小鼠肝癌模型进行治疗的效果，为临床的肿瘤治疗提供一种新的思路。

技术领域

本发明属于基因工程、免疫学和肿瘤学技术领域，特别涉及一种利用CRISPR/Cas9技术敲除Endoglin基因的方法及其应用。

背景技术

肿瘤(Tumor) 是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的异常病变而产生的，20世纪后期近30年以来，癌症发病一直呈上升的趋势，据世界卫生组织(WHO)报告,1990年全球癌症新发病例数约807万，比1975年的517万增加了37.4%，而1997年全球的癌症死亡数约620万，并且按目前的趋势预测，至2020年随着世界人口达80亿，将有2000万新发癌症病例，其中死亡人数将达1200万，且其中绝大部分将发生在发展中国家；几十年来，由于生态环境的不断恶化、艾滋病等疾病的传播，恶性肿瘤的发病率呈上升趋势，并成为继心血管疾病之后的第二大致死病因，特别是肝癌，是威胁全世界人类健康及生命重要的因素之一，其中又以实体肿瘤最多见。实体肿瘤的发生、增长以及转移的基础是源于肿瘤内血管的形成和发展，是肿瘤细胞进行新陈代谢途径的关键。肿瘤血管的形成主要包括两个阶段，即肿瘤血管形成前期和血管形成后期。在肿瘤血管形成前期，肿瘤细胞仅仅依靠单纯的细胞增殖能力进行平稳的增殖，单纯扩散的方式进行营养物质的摄取与代谢产物的排放，形成无血管结构的细胞团，因此肿瘤的增殖能力较弱，肿瘤仅仅能够生长至几立方毫米左右，当这种简单的物质代谢途径不能满足肿瘤增长时，肿瘤即进入一个相对静止的增长期。在肿瘤血管形成后期，肿瘤细胞可以释放多种细胞因子，从而诱导肿瘤血管的形成，在机体本身的血管组织向肿瘤部位发出毛细血管幼芽，当形成肿瘤新生血管时，肿瘤细胞的营养供给充足，进入对指数生长阶段，并且通过血管对肿瘤细胞向向邻近组织进行输送，发生转移。由此可见，肿瘤中微血管形成越多，肿瘤的生长速度越快，转移及扩散越广泛，因此发现一种可靠的血管标志物来作为肿瘤临床诊断及治疗的依据。

基因编辑技术（Gene Editing Technology），作为人们研究基因功能的主要方法，近年来一直飞速发展，而CRISPR/Cas9基因编辑技术和转录激活因子样效应子核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）技术作为近几年的热门技术，是众多学者研究和应用的对象。规律间隔的短回文重复序列（clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats, CRISPR）简称CRISPR序列，其系统主要由两部分构成为重复序列和间隔序列交替排列所形成的CRISPR基因座和其上游的Cas蛋白家族的操纵子。其中，CRISPR基因座中的间隔序列(protospacers)源自于细菌对外源性DNA的拷贝，具有特异性识别外源性DNA的功能。

Endoglin是一种胞膜形成所必须的蛋白质，主要在人类内皮细胞表面和胎盘滋养层细胞表面表达。有研究表明，在增殖活跃的肿瘤细胞中可以检测到Endoglin的高表达，同时也有研究在临床样本检测及动物实验中得出结论，在新生血管内皮细胞表面Endoglin表达程度明显升高，尤其是在内皮细胞增至状态良好，呈对指数增长时高表达，因此通过以上研究表明，Endoglin可以作为新生血管内皮细胞的主要标志，而且Endoglin的表达程度的高低可以用来衡量血管内皮细胞的增至状态。

因此，提出一种利用CRISPR/Cas9技术敲除Endoglin基因的方法及其应用是本领域技术人员研究的新的思路。

发明内容