[发明专利]一种针对于雌性基因编辑的方法

说明书

本发明公开了一种针对于雌性基因的编辑方法，包括以下步骤：孤雌受精卵的获得、孤雌受精卵基因编辑、编辑后孤雌胚胎卵裂球的分离、重构孤雌胚胎、编辑结果的鉴定。本发明的方法能够间接的实现对哺乳动物卵子进行精准编辑的功能，并且能够确保最终基因编辑的效果，利于基因编辑技术向临床医学的转化。

技术领域

本发明涉及一种雌性基因的编辑方法，更具体地，涉及一种基因编辑技术结合细胞核移植技术进行雌性基因编辑的方法。

背景技术

基因编辑技术目前在研究领域获得了越来越多的进展，并在人类的细胞样本中进行了大规模的尝试。但目前基因编辑技术的主要风险仍然是编辑效率以及脱靶问题，这对于临床的推广使用尤为关键，只有克服了相关的风险，才能安全的向临床进行推广。目前针对于胚胎基因编辑，在不对胚胎的所有细胞进行检测之前我们无法明确编辑的效率，故检测之前我们无法预判哪个细胞是成功编辑的，哪个细胞是编辑失败的。但一旦经过分子检测，则该细胞将失去利用价值，这对于胚胎本身来说是致命的。另外一方面，在现有的技术条件下，无法对哺乳动物的雌性染色体进行相关的基因编辑，这进一步限制了基因编辑技术将来的应用范围。

发明内容

为了有效的对雌性基因进行100％成功编辑，本发明提供了一种基因编辑技术联合核移植技术的基因编辑方法，能够实现对雌性基因编辑效果确认后并加以利用。

为了解决以上技术问题，本发明提供一种针对于雌性基因的编辑方法，包括以下步骤：

1)孤雌受精卵的获得：制备仅含有单倍孤雌染色体的孤雌受精卵；

2)孤雌受精卵基因编辑：在原核期利用基因编辑技术对所述孤雌受精卵的目的基因进行编辑；

3)编辑后孤雌胚胎卵裂球的分离：将步骤2)编辑后的孤雌受精卵进行胚胎培养至具有卵裂球的时期，分离出其中一个卵裂球；

4)重构孤雌胚胎：将步骤3)分离出来的卵裂球与MII期卵母细胞进行重构，得到重构孤雌受精卵，将所述重构孤雌受精卵继续进行胚胎培养至具有卵裂球的时期；

5)编辑结果的鉴定：取出步骤4)培养得到的一个卵裂球进行编辑结果的鉴定，步骤4)得到的剩余卵裂球的基因组与用于鉴定的卵裂球的基因组完全一致；

所述方法用到的所有细胞和染色体均来源于非人类哺乳动物。

上述方法中，步骤1)中制备所述孤雌受精卵的方法包括以下a或b所述的步骤：

a.将单精子注射到MII期卵母细胞使其激活受精，在原核期去除雄原核保留雌原核；

b.将MII期卵母细胞进行孤雌激活。

上述方法中，步骤b中所述激活的方法为化学激活、电激活，优选为钙离子载体A23187联合嘌呤霉素的化学激活方式激活。

上述方法中，步骤2)中所述基因编辑技术为锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effectornuclease,TALEN)或CRISPR/Cas9技术；

所述编辑的方式为对所述目的基因进行碱基修饰、碱基插入、碱基敲除和碱基替换中的一种或多种。

上述任一所述的方法中，步骤3)和步骤4)中所述具有卵裂球的时期为2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、32细胞期、融合胚期、桑葚胚期或囊胚期。

上述任一所述的方法中，步骤4)中所述重构的方式为电融合、病毒融合和细胞注射中的一种或多种。

上述任一所述的方法中，步骤4)中所述重构孤雌受精卵的方法包括以下i-iii任一项所述的步骤：