[发明专利]一种蛹虫草高活性菌种选育方法

权利要求书

1.一种蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，所述蛹虫草高活性菌种选育方法利用人工分离蛹虫草单孢子菌种，采用分子生物学方法鉴定蛹虫草基因交配型；通过筛选高产多糖、腺苷、虫草素活性物质的单孢子菌种；并经过营养亲和性试验，选择一定活性物质代谢能力强并且营养亲和的一对不同基因交配型蛹虫草单孢子菌种，进一步通过出草验证获得子实体高产并且子实体中多糖的活性物质高的目标菌株。

2.如权利要求1所述的蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，所述利用人工分离蛹虫草单孢子菌种，采用分子生物学方法区分蛹虫草交配型，包括：通过对蛹虫草分生孢子进行单孢分离获得单孢菌株，利用PCR检测获得mat-alpha和mat-HMG两种交配型单孢株。

3.如权利要求1所述的蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，所述通过筛选高产活性物质的单孢子菌种，包括：利用对获得mat-alpha和mat-HMG两种不同交配型单孢株分别接种到摇瓶内，200rpm/min培养7天后测摇瓶菌丝中腺苷、虫草素活性物质，筛选高产活性成分的单孢子菌种保留。

4.如权利要求1所述的蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，所述进一步通过出草验证获得高产目标菌株，利用选育方法获得蛹虫草菌株菌种，包括：按照mat-alpha与mat-HMG菌株营养亲和性分析获得营养亲和的株，进一步通过该出草验证，获得一对成功配对，子实体产量高并且子实体富含虫草多糖、腺苷的活性物质的单孢子菌株。

5.如权利要求1所述的蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，所述基于蛹虫草交配型的蛹虫草高产栽培方法，具体包括：

蛹虫草单孢株的获得；

单孢株交配型的PCR检测及两种交配型的液体培养；

柞蚕蛹活体接种及子实体的培养；

米饭培养基接种及子实体的培养。

6.如权利要求5所述的蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，蛹虫草单孢株的获得，具体包括：

将蛹虫草原始菌株和传代多次的蛹虫草菌株接种到SDAY培养基上，22℃培养14天，取少量分生孢子于已加入无菌吐温80溶液三角瓶中，剧烈涡旋后过滤，用血球计数板计数孢悬液浓度，梯度稀释成100个孢子/mL的孢悬液；

用微量移液器取10μL孢子悬浮液滴加在40mm PDA培养基平板上中心位置；

22℃恒温箱培养24h至孢子刚萌发伸长，分析培养皿中孢子萌发情况，标记好萌发出芽管的单孢子位点，继续培养24h后，再依次分析培养皿中菌丝萌发情况，将只带有一个孢子且已正常萌发出和菌丝的培养皿培养基中心位置的培养基，用接种铲转接到90mm PPDA培养基平板上，22℃恒温箱继续培养至单菌落，为单孢株。

7.如权利要求5所述的蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，单孢株交配型的PCR检测及两种交配型的液体培养，具体包括：

利用氯化苄方法提取蛹虫草单孢株基因组，PCR检测其交配型；

分别取mat-alpha和mat-HMG单孢株接种到摇瓶中，避光22℃、200rpm/min，培养7d，收集菌丝体，采用HPLC法建成菌丝体中腺苷、虫草素和多糖的含量，分别各选10株mat-alpha和mat-HMG单孢株活性成分含量相对较高的菌种进一步进行营养亲和性分析；

分别取mat-alpha和mat-HMG单孢株点接到同一PPDA培养基平板上，相聚1.5-2cm，22℃恒温箱继续培养至两单孢子菌株菌落靠近，判断两菌株的营养亲和性，保留营养亲和性配对菌株。

8.如权利要求5所述的蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，柞蚕蛹活体接种及子实体的培养，具体包括：

将筛选得到的营养亲和的配对菌种斜面种子，分别接种1cm²的菌苔接种到摇瓶中，避光22℃、200rpm/min，培养5d获得液体种子，用无菌注射器吸取混合菌液注射到柞蚕蛹体内，每个柞蚕蛹注射200Ul；

将注射好的柞蚕蛹放到无菌罐头瓶内，每瓶放2个；避光16℃培养15d，然后换做16℃避光7h、22℃光照17h培养5d，最后22℃光照培养45d。

9.如权利要求5所述的蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，米饭培养基接种及子实体的培养，具体包括：

将筛选得到的营养亲和的配对菌种斜面种子，分别接种1cm²的菌苔接种到摇瓶中，避光22℃、200rpm/min，培养5d获得液体种子，用移液器吸取混合菌液均匀喷洒到装有米饭培养基表面的培养瓶内，每瓶米饭培养基喷洒3ml；

将接种好的米饭培养基避光18℃培养15d，然后换做22℃光照17h培养6d，最后22℃光照培养40d。