[发明专利]通过考察候选肽段的酶解稳定性筛选出奶粉过敏蛋白的特征肽段的方法

说明书

本发明公开了通过考察候选肽段的酶解稳定性筛选出奶粉过敏蛋白的特征肽段的方法，具体涉及食品检测领域，该方法包括如下步骤：在样本溶液中依次加入三乙基碳酸氢铵缓冲液和二硫苏糖醇，并加入碘代乙酰胺，反应后得到待酶解样本溶液，且通过酶解得到酶解溶液。酶解溶液采用二甲基标记得到轻标溶液和重标溶液。将轻标溶液与重标溶液按质量比为1:1混合，采用纳流液相色谱串联Q‑Exactive高分辨质谱鉴别得到候选肽段。采用超高性能液相色谱串联三重四级杆对可识别的质谱信息所对应的候选肽段进行相对定量分析，筛选出峰面积比的相对标准偏差<10％的候选肽段，即得到特征肽段。本发明具有可筛选出性能最优的特征肽段的优点。

技术领域

本发明涉及食品检测领域，具体为通过考察候选肽段的酶解稳定性筛选出奶粉过敏蛋白的特征肽段的方法。

背景技术

在以蛋白质组学为基础的食品检测过程中，通常需要通过被测蛋白质酶解出来的特征肽段来对目标蛋白质进行定性及定量的分析，因此特征肽段的筛选是个非常重要的步骤。在筛选特征肽段的过程中，人们通常的做法是通过高分辨质谱筛选出候选多肽，然后根据候选肽段在低分辩质谱中的表现及其自身特性来进行挑选。常用的挑选规则有：1.候选肽段对于被测蛋白质具有唯一性；2.候选肽段在低分辩质谱中有比较好的信号值；3.候选肽段不能有翻译后修饰位点；4.候选肽段不能有蛋白酶漏切位点；5.酶解后的特征肽段在食品基质中具有较高的丰度；6.多肽长度应该在10-20氨基酸个数之间。

然而，问题也随之而来。根据上面这些规则筛选出来的特征肽段通常有上百种，而实际在低分辩质谱中使用的仅仅需要几条性能最佳的肽段。当候选肽段数量过多时，没有蛋白质组学技术背景的理化检测人员不能够合理有效的使用这些特征肽段去检测试剂样品。由于目前现有的筛选方法只能从理论高度对此进行评估，缺乏实际验证，而且这些筛选条件过于空泛，仅仅能够筛去部分候选肽段，但是无法选出最佳的特征肽段。为了解决现有对特征肽段筛选困难的问题，急需要一套有效的方法帮助人们筛选出性能最优的特征肽段。

发明内容

本发明提供了通过考察候选肽段的酶解稳定性筛选出奶粉过敏蛋白的特征肽段的方法，该方法具有可筛选出性能最优的特征肽段的优点。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

通过考察候选肽段的酶解稳定性筛选出奶粉过敏蛋白的特征肽段的方法，该方法包括如下步骤：

S01、将样本奶粉溶解在溶剂中，得到样本溶液。

S02、根据不同种类的样本奶粉所对应的过敏源信息筛选过敏蛋白。其中，技术人员可通过网站或者是文献上给出的所检测的样本奶粉的种类对应的过敏蛋白的信息，筛除丰度低以及在相关产品中会发生交叉反应的过敏蛋白，从而得到候选蛋白。

S03、(1)在所述的样本溶液中依次加入三乙基碳酸氢铵缓冲液和二硫苏糖醇，反应完成后，加入碘代乙酰胺，并放置于暗处或遮光反应，得到待酶解样本溶液；

(2)于待酶解样本溶液中加入蛋白酶，酶解反应完成后，即得到酶解溶液；

S04、在酶解溶液中，分别依次加入体积分数为4％的CH₂O溶液和浓度为0.6mol/L的氰基硼氰化钠溶液，充分反应后，分别依次加入160μL体积分数为1％的氨水溶液与80μL体积分数为5％的甲酸溶液，反应完成后，得到二甲基标记完成的轻标溶液。

S05、在酶解溶液中，分别依次加入体积分数为4％的¹³CD₂O溶液和浓度为0.6mol/L的氰基硼氰化钠溶液，充分反应后，分别依次加入160μL体积分数为1％的氨水溶液与80μL体积分数为5％的甲酸溶液，反应完成后，得到二甲基标记完成的重标溶液，即为内标溶液。