[发明专利]一种玻璃酸酶精品的提取方法

说明书

本发明公开了一种玻璃酸酶精品的提取方法。该提取方法包括下列步骤：(1)在0‑10℃下将玻璃酸酶粗品与水混合，调节pH4.0‑5.0；(2)将(1)得到的溶液用水进行透析；(3)在0‑10℃下将(2)得到的透析液离心得上清液，依次加入磷酸三钠水溶液和乙酸钙水溶液，调节pH8.0‑9.0；将得到的溶液在0‑10℃下离心，取上清液与活性炭混合；将得到的溶液在0‑10℃下离心得上清液，依次加入磷酸三钠水溶液和乙酸钙水溶液，调节pH8.0‑9.0；(4)将(3)得到的溶液进行抽滤，调节pH6.0‑8.0后进行过滤取滤液，再用纳米膜过滤。本发明得到的玻璃酸酶的效价和稳定性更高，更加符合生物制品的质量标准。

技术领域

本发明涉及一种玻璃酸酶精品的提取方法。

背景技术

玻璃酸酶是由哺乳动物如牛、羊睾丸提取或微生物发酵制得的糖苷内切酶。玻璃酸酶催化透明质酸等酸性黏多糖水解，产生以丁糖为主的偶寡糖，使透明质酸的黏滞性明显下降，从而降低组织黏度，提高毛细血管和组织的通透性，加速细胞内外物质的扩散，是一种重要的药物扩散剂。Fe²⁺、Cu²⁺离子对酶有可逆抑制作用。Pb²⁺、Hg²⁺、Ni²⁺、等离子对酶活性没有明显影响。在氯化钠(0.15mol/L)或硫酸鱼精蛋白的存在下，硫酸软骨素B(皮肤素)、硫酸类肝素、硫酸角质素、肝素钠及高浓度玻璃酸对玻璃酸酶的抑制作用可被逆转。

玻璃酸酶为白色无定形粉末或颗粒，易溶于水，不溶于丙酮、乙醇和乙醚。最适pH值4.0～7.5。玻璃酸酶液态常温可稳定24h，5℃以下可稳定一周，100℃加热30min失活。玻璃酸酶稳定性较好，42℃持续加热60min活力不损失，100℃持续加热5min活力可保留80％。在低浓度的水溶液中较易失活，一般可用明胶或阿拉伯胶保护防止失活。

药用玻璃酸酶为白色或微黄色粉末，无气味，易溶于水，不溶于丙酣、乙醋、乙醇等有机溶剂。生化制药主要用牛、羊睾丸为原料进行提取制备。玻璃酸酶根据其种类、分子量大小、最适pH值、降解底物的机理不同，分离提取方法有很多，如色谱法，乙醇法等等，例如国内传统工艺是用酸液溶解和硫酸铵盐析的方法来提取玻璃酸酶粗品，粗品经透析、冻干得玻璃酸酶精品的。但在提纯过程中损耗较大，也缺乏去病毒的工艺验证；产品的效价通常仅能达到320IU/mg，效价低，杂质含量高。

随着国家药品标准对生物药质量要求进一步的提高，玻璃酸酶的质量标准也更加的严格。中国药典2010版规定玻璃酸酶酸度在4.5～7.5；干燥失重<5.0％；酪氨酸含量<0.1微克；玻璃酸酶效价≥300单位。因此，研发一种提取获得效价更高、更稳定并且符合生物制品的质量标准的玻璃酸酶精品的方法是亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的玻璃酸酶的提取工艺收率低，效价低等缺陷，而提供了一种玻璃酸酶精品的提取方法。该方法可得到具有更高的效价和稳定性的玻璃酸酶，而且更加符合生物制品的质量标准。

本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题。

本发明提供了一种玻璃酸酶精品的提取方法，其包括下列步骤：

(1)预处理：在0-10℃下将玻璃酸酶粗品与水混合，之后调节pH至4.0-5.0；

(2)透析：将步骤(1)得到的溶液用水进行透析，所述透析所用的透析纸的截留分子量不大于10K；

(3)去细菌内毒素：S1：在0-10℃下将步骤(2)得到的透析液离心得上清液，之后依次加入磷酸三钠水溶液和乙酸钙水溶液，用氢氧化钠调节pH至8.0-9.0；S2：将S1中得到的溶液在0-10℃下离心，之后取上清液与活性炭混合；S3：将S2中得到的溶液在0-10℃下离心得上清液，之后依次加入磷酸三钠水溶液和乙酸钙水溶液，然后调节pH至8.0-9.0；