[发明专利]产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒

说明书

本发明公开了一种产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒，涉及试剂盒技术领域。本发明包括40μL特异性引物、250μL荧光定量PCR反应混合液(Premix Ex Taq)、20μL ROX Reference Dye、20μL阴性对照、20μL阳性对照、500μL超纯水；根据GenBank中猪源产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)耐热肠毒素(STⅡ)基因序列，设计1对特异性引物，进行试验，试验方法灵敏度可达1.0×10¹拷贝/μL，重复性好，将PCR产物测序结果与GenBank中的ST基因序列比对，相似度为98.2％～100％。本发明试剂盒具有检测速度快、检出率高的特点。

技术领域

本发明涉及试剂盒技术领域，尤其是产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因SYBRGreen I荧光定量PCR诊断试剂盒。

背景技术

产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起仔猪腹泻的重要病原菌，初生仔猪被ETEC感染后，常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡。ETEC引起仔猪腹泻的主要病原是具有宿主特异性的黏附素(F4、F5)和肠毒素(袁万哲，何孔旺，陆承平，等.产肠毒素性大肠杆菌主要毒力因子的研究进展[J]，动物医学进展，2005，26(2)：6-9)。ETEC通过细菌表面的黏附素吸附到小肠上皮细胞，然后在小肠内定居和增殖(SommerU,Petersen J,Pfeiffer M,Schrotz-King P,Morsczeck C.2010.Comparison of surfaceproteomes of enterotoxigenic(ETEC)and commensal Escherichia coli strains[J].JMicrobiol Methods,83(1):13-19)，但这并不能影响小肠上皮细胞的正常功能，直到ETEC产生的肠毒素分泌到菌体外并作用于小肠上皮细胞表面，才会改变小肠的吸收和分泌功能，引起水和电解质大量蓄积，导致小肠上皮细胞的代谢发生紊乱，出现腹泻和脱水的症状(Nicklasson M,Sjoling A,Lebens M,Tobias J,Janzon A,Brive L,Svennerholm AM.2008.Mutations in the periplasmic chaperone leading to loss of surfaceexpression of the colonization factor CS6 in enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC)clinical isolates[J].Microb Pathog,44(3):246-254)。ETEC主要有不耐热性肠毒素(Heat-labile toxin，LT)和耐热性肠毒素(Heat-stable toxin，ST)。检测肠毒素对大肠杆菌腹泻病的诊断有极其重要的意义。

目前，检测大肠杆菌肠毒素的方法主要有动物试验、凝集试验、琼脂扩散试验，这些方法不仅费时费力，还有一定的局限性，如华荣虹等《猪源肠毒素菌毛基因多重PCR检测方法的建立》，曾群辉等《牦牛大肠埃希氏菌的肠毒素试验》。随着分子生物学技术的发展，该菌株的肠毒素基因相继被克隆和测序，从基因水平的基础上鉴定大肠埃希菌的菌型及致病性。成大荣等《仔猪腹泻源大肠杆菌的PCR快速检测》通过PCR方法对临床上采集的腹泻仔猪的直肠棉拭子样品进行检测，与常规的细菌分离进行比较，证明PCR方法可对大肠埃希菌病病原进行快速的检测和鉴定。但常规PCR需通过凝胶电泳进行鉴定，费时费力，且只能定性不能定量。荧光定量PCR技术已应用到微生物检测，从敏感性、特异性和速度上都具有优势。冯洁等《啮齿柠檬酸杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立》建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测啮齿柠檬酸杆菌，结果表明检测率高。但是，现有技术中并未存在对猪源产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因提供快速准确诊断的PCR诊断试剂盒，使得对猪源产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因的诊断和检测依然存在操作繁琐，敏感性低，且只能定性不能定量等缺陷。

发明内容