[发明专利]一种基于微流控芯片的检测甲型、乙型流感病毒的试剂盒及其使用方法

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于微流控芯片的检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒及其使用方法，包括主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂、阳性质控品；使用时，将样品DNA/RNA共提取模板加入微流控核酸检测芯片的加样孔中，盖好加样孔盖，放入微流控芯片检测仪中检测；进行PCR扩增并进行结果判定。本发明与普通荧光PCR法、免疫法和细菌培养法等相比，具有以下优势：特异性强：本发明的引物探针针对甲型/乙型流感病毒的特异性保守区域序列设计，特异性强；敏感性高：本发明能检测到10copies/μL浓度的目的基因序列；易于保存：本发明的在微流控芯片内预装干粉试剂，保存方便。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于微流控芯片的检测甲型、乙型流感病毒的试剂盒及其使用方法。

背景技术

流行性感冒病毒(influenza virus，Flu)，简称流感病毒，分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，近年来才发现的牛流感病毒将归为丁(D)型。流感病毒可引起人、禽、猪、马、蝙蝠等多种动物感染和发病，是人流感、禽流感、猪流感、马流感等人与动物疫病的病原。人流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的，主要引起上呼吸道感染，也可以引起儿童与成人的下呼吸道感染，主要为肺炎，婴幼儿的重症流感常伴有支气管炎、高热，偶尔伴有脑炎、中耳炎、心肌炎等并发症。流感病毒主要经空气飞沫传播，甲型流感病毒常以流行形式出现，可造成世界大流行；乙型流感病毒常造成局部爆发流行。利用分子诊断技术可以快速检测流感病毒，从而进行辅助诊断，对临床治疗有一定的指导意义。

主要的甲乙丙流感病毒中，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型极少引起流行。甲型流感病毒(Flu A)感染发病程度与个人免疫相关，典型症状以畏寒、持续高热、头痛为主，同时伴有喉痛、咳嗽、鼻塞，一般会有浑身酸痛、乏力等全身症状。发病率高、病死率底，死亡通常由并发细菌性感染所致。潜伏期1～7天，甲型流感常引起大流行，每年均有一个高峰，病毒型别表现为交替流行的规律。文献报道流行期阳性检出率为20％～40％，而在非流行季节的阳性率为2％～20％。

乙型流感病毒(FluB)感染起病迅速，患者畏寒、发热，体温在数小时至24小时内升达高峰，39～40℃甚至更高。伴有头痛，全身酸痛，乏力，食欲减退。呼吸道症状较轻，咽干喉痛，干咳，可有腹泻。颜面潮红，眼结膜外眦充血，咽部充血，软腭有滤泡等。潜伏期3～7天，乙型病毒常引起局限性流行，流感患者中，乙型流感病毒感染约占10％～40％。文献报道流行期间阳性率为10％～30％，在非流行季节阳性率2％～10％。

微流控芯片(microfluidics)或称芯片实验室(Lab-on-a-Chip)是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备，生物与化学反应，分离、检测等基本操作单元或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。这种技术原则上适用于从核酸、蛋白质直到有机、无机小分子的各种不同类型分子的反应、分离和检测。微流控芯片具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点,它可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析,并且可以在线实现样品的预处理及分析全过程。

目前市场上针对甲型流感病毒和乙型流感病毒的检测方法主要有荧光PCR法、免疫法和细菌培养法。荧光PCR法是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时监测，定性或定量检测目的基因；免疫法是通过抗原抗体发生特异性结合来检测目的蛋白；培养法是把病原体在特定培养基上进行培养，再对产生的结果进行观察分析。

目前市场上针对甲型流感病毒和乙型流感病毒的荧光定量PCR检测试剂盒有很多，针对甲型流感病毒和乙型流感病毒最为常见的一些亚型设计引物探针进行检测。其组成一般包括盐离子缓冲液、酶、引物、探针、质控品，以液态形式分管保存在-20℃下，使用时需要将多管试剂融化，按照一定的比例进行混合，配制成检测反应液，然后加入样本核酸，放入荧光定量PCR仪中进行检测，最后根据扩增曲线分析检测结果。