[发明专利]sgRNA及其制备的Gal抗原缺失兔子模型和应用

说明书

本发明涉及一种sgRNA及其制备的Gal抗原缺失兔子模型和应用，属于动物模型建立技术领域。该sgRNA为针对兔物种GGTA基因，其基因组编号为LOC100348435的第8外显子的正链及互补链上满足(N)₂₀AGG序列模式的序列部分分别设计得到的识别序列，所述sgRNA分别记为第一sgRNA识别序列和第二sgRNA识别序列。采用该Cas9‑GGTA/sgRNA制备得到的Gal抗原缺失兔子模型，其纯合子失去了Gal抗原的表达能力，与人体具有相似的抗‑Gal抗体的表达趋势；因此，该Gal抗原缺失兔子模型可以用于动物源性生物材料，动物组织、器官及其衍生物的免疫学研究，动物源性医疗产品的宿主植入反应评价，动物源性膜类生物材料的钙化试验研究和植入类动物源性生物材料类医疗产品的有效性评价。

技术领域

本发明涉及动物模型建立技术领域，特别是涉及一种sgRNA及其制备的Gal抗原缺失兔子模型和应用。

背景技术

已有研究显示，异种抗原α-半乳糖基抗原(α-1，3-galactosyle，α-Gal，即：Gal抗原)是动物源性生物材料或异种器官移植超急性免疫排斥反应中的主要靶抗原。Gal抗原是含有聚乳糖胺核心末端残基的细胞表面分泌型糖蛋白或糖脂，广泛存在于猪、兔子等低等动物体内。Gal抗原主要受α-1，3半乳糖基转移酶(α1，3-galactosyltransferase，α-1，3GT或者GGTA1)调控。由于人体及类人猿、旧世纪猴的半乳糖基转移酶基因有2个碱基错位变异而不表达Gal抗原，但人血清中存在高滴度的抗-Gal抗体(占总血清球蛋白的1～5％)，因此当人体接受含有Gal抗原的生物材料或异种器官移植时会导致超急性免疫排斥反应及慢性的免疫毒性反应。

国际上早在90年代就有通过构建GGTA1基因敲除小鼠，来研究Gal抗原相关的免疫学反应，探讨不含Gal抗原的克隆动物的构建方法和可行性。在1996年，RG Tearle等报告了GGTA1基因敲除小鼠模型的成功制作方法。之后开始有报告使用GGTA1基因敲除小鼠模型研究其与人所诱导抗体的相似性及其免疫学特征。这些研究提示GGTA1基因敲除小鼠模型对Gal抗原残留诱导的免疫毒性具有敏感的反应性。在2000年初研究者们开始了GGTA1基因敲除猪的研究，甚至GGTA1基因敲除牛的研究，期望能够直接从GGTA1基因敲除猪或牛获得没有Gal抗原的组织或器官，以避免动物源性生物材料及异种脏器移植的免疫排斥反应。

然而，目前还没有成功制备GGTA1基因敲除兔子的报道，亟需一种可用于猪、牛等异种组织/器官移植和动物源性生物材料，动物组织、器官及其衍生物的免疫学研究的GGTA1基因敲除Gal抗原缺失兔子模型。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种sgRNA及其制备的Gal抗原缺失兔子模型和应用，该模型可用于猪、牛等异种组织/器官移植和动物源性生物材料，动物组织、器官及其衍生物的免疫学研究；可作为动物源性生物材料/医疗产品的人体植入反应试验模型和植入后组织再生、修复、重建的有效性评价模型；可用于膜类动物源性生物材料/医疗产品的钙化试验研究。

一种用于Gal抗原缺失兔子模型制备的sgRNA，所述sgRNA为针对兔物种基因组编号为LOC100348435的第8外显子的正链及互补链上满足(N)₂₀AGG序列模式的序列部分分别设计得到的识别序列，所述sgRNA分别记为第一sgRNA识别序列和第二sgRNA识别序列；其中，所述第一sgRNA识别序列与所述第8外显子的互补链上序列(N)₂₀AGG一致，所述第二sgRNA识别序列与所述第8外显子的正链上序列(N)₂₀AGG一致，N为A、T、C或G，下标20表示N的个数。