[发明专利]一种血浆直接亚硫酸氢盐转化的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种血浆直接进行亚硫酸氢盐转化的方法及其应用。本发明所述方法与市面上同类亚硫酸氢盐转化产品最大的优势在于无需提取血浆游离DNA，血浆可直接作为亚硫酸氢盐转化样本，既节省了提取游离DNA的时间，又可以避免在提取过程中游离DNA的损耗。其次，本发明所述方法为了保护DNA免受杂蛋白、脂质等的影响，在亚硫酸氢盐转化体系中加入了保护剂。另外，为了进一步提高游离DNA的回收率，本发明采用高灵敏度的磁珠进行回收。整个转化过程不超过2小时，不涉及离心操作，更易于实现自动化。本发明所述方法具有成本低、操作简便、转化率高和所得DNA纯度高等优点。

技术领域

本发明属于分子生物学研究领域，涉及一种核酸的转化及纯化方法，具体涉及一种血浆直接亚硫酸氢盐转化的方法及应用。

背景技术

DNA甲基化是指在甲基转移酶的催化作用下，DNA在CpG岛中的胞嘧啶(Cytosine，C)被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)。在真核生物中，大约60％～90％的CpG二核苷酸中的胞嘧啶呈甲基化状态。

DNA甲基化的研究一直被作为表观遗传学研究的重点内容，近年研究发现，DNA甲基化与胚胎的发育、基因表达的调控、肿瘤的产生及多种疾病的发生密切相关。随着科学技术的发展，越来越多的检测手段应用于DNA的甲基化检测中，但是，亚硫酸氢盐转化是众多检测手段中必不可少的一部分。亚硫酸氢盐转化即通过亚硫酸氢盐作用于游离DNA，结果表现为未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶(Uracil，U)，而发生甲基化的胞嘧啶保持不变，从而达到区分甲基化胞嘧啶与未甲基化胞嘧啶的目的。

传统亚硫酸氢盐转化方法须耗时18h左右，市面所见亚硫酸氢盐转化试剂盒所需时间约为6h，操作步骤繁琐且耗时长，并且目前市面上亚硫酸氢盐转化试剂盒均需要提取血浆游离DNA，以DNA作为亚硫酸氢盐转化的样本。转化后的DNA回收大多采用柱式离心法，操作过程需借助离心机完成，不易实现自动化。甲基化检测应用于临床检测势在必行，因此，急需获得一种快速、简便、得率高的亚硫酸氢盐转化试剂盒。

基于目前表观遗传学的研究现状和亚硫酸氢盐转化试剂盒的市场现状，本发明提出了一种血浆直接亚硫酸氢盐转化的方法。本发明最大的优势在于无需提取游离DNA，血浆可直接进行亚硫酸氢盐转化，有利于简化试验操作和节省试验成本，所得DNA转化率高，更易于实现自动化，能够更好的应用于临床试验。

发明内容

本发明的目的在于提出一种用于血浆直接亚硫酸氢盐转化的方法及其应用，该方法无需进行游离DNA的提取，直接将血浆作为亚硫酸氢盐转化的样本即可，并且采用高灵敏度的磁珠进行回收，此种方法能够获得高转化率、高纯度的DNA，同时，大大简化了操作步骤、节省操作时间，降低试验成本。

为实现上述目的，本发明中涉及的血浆亚硫酸转化包括以下步骤：

(1)向离心管内加入1.0mL血浆、1～1.5×样本体积样本处理液、20～30μL蛋白酶K和120～180μL亚硫酸氢盐溶液，涡旋混匀，50～65℃条件下恒温孵育40～60min；

(2)向上述反应液中加入20～35μL磁珠和200～400μL结合液，涡旋混匀，调节恒温振荡器转速800～1500rpm，温度18～50℃，孵育20～60min，孵育结束后将反应管置于磁力架，静置1-10min，用一次性移液器吸去残余液体；

(3)加入500～800μL漂洗液I，涡旋混匀，短暂离心，所得反应液置于磁力架，静置1～10min，用一次性移液器吸去残余液体；

(4)加入600～1000μL漂洗液II，涡旋混匀，短暂离心，所得反应液置于磁力架，静置1～10min，用一次性移液器吸去残余液体；

(5)重复步骤(4)，反应管置于磁力架上，室温开盖5～10min保证管内水分蒸发完全；