[发明专利]构建LCAT基因敲除仓鼠模型的系统和方法

说明书

本发明公开了一种构建卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)基因敲除仓鼠模型的系统和方法，所述系统包括仓鼠LCAT基因特异性打靶序列sgRNA和放大sgRNA的PCR引物。所述方法包括：设计所述仓鼠LCAT基因特异性打靶序列、制备所述cas9mRNA和sgRNA；收集和培养仓鼠受精卵；显微注射：将所述sgRNA和cas9 mRNA共同注射至仓鼠受精卵的细胞质中；最后将显微注射后的受精卵植入代孕仓鼠体内，F1代仓鼠出生，经鉴定构建了LCAT基因敲除的仓鼠模型。

技术领域

本发明涉及疾病动物模型及其制备技术领域，具体地，涉及一种心血管疾病动物模型及其构建方法，尤其是一种卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)基因敲除仓鼠的构建方法和系统。

背景技术

卵磷脂胆固醇酰基转移酶(Lecithin—cholesterol acyltransferase，LCAT)是催化高密度脂蛋白(High-density lipoprotein，HDL)中游离胆固醇的酯化酶，并接受外周组织包括动脉壁的胆固醇，转运到肝脏降解，是胆固醇逆转运的关键因子之一。在脂蛋白代谢途径中，LCAT对胆固醇、甘油三酯、磷脂的代谢都起到重要调节作用。人群调查研究发现，LCAT增高对冠心病有保护作用；而以小鼠为模型的研究则发现LCAT转基因过表达可促进动脉硬化(atherosclerosis,缩写As)，敲除LCAT反而减轻As，与LCAT在胆固醇逆转运中的作用以及人群中的研究结果明显相悖。因此，必须应用拟人化动物模型，才能阐明LCAT究竟是延缓还是促进冠心病的发生发展这样一个重要科学问题。

在基因工程小鼠技术建立之后，虽然小鼠成为疾病动物模型的主要模式动物，然而科研人员越来越认识到小鼠疾病和人类疾病的区别。因此，研发和构建人源化、类人化动物模型开展转化医学研究，也是近年来生物医学领域发展的一个方向。随着近年来基因工程仓鼠的研究不断进展，其在代谢性心血管病研究中的优势逐步被广泛地重新认识。和小鼠、家兔相比，仓鼠的糖脂代谢机制和人类更加相似，包括对高脂饮食的反应性，血浆脂质谱有较高的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)组分，表达胆固醇酯转运蛋白(CETP)、HL、ApoAII，肝脏编辑ApoB100，高果糖饲料能诱导2型糖尿病，因此在代谢性心血管病研究上优势非常明确。

基于仓鼠的类人化特点，对仓鼠的LCAT基因敲除(LCAT-/-)和转基因，有可能为争议中的LCAT对As的影响提供比较明确的答案，为进一步的干预方法研究提供理论基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种构建LCAT基因敲除仓鼠模型的系统和方法。本发明实施例应用高效基因组编辑CRISPR/Cas9技术，构建出LCAT基因敲除的拟人化仓鼠动物模型，用于解决临床和基础研究中一直争议的LCAT和动脉粥样硬化的关系问题。

为实现上述目的，本发明实施例采用的技术方案是：

一种构建LCAT基因敲除仓鼠模型的系统，所述系统包括仓鼠LCAT基因特异性打靶序列和sgRNA：

所述仓鼠LCAT基因特异性打靶序列如SEQ ID NO:1所示；

所述sgRNA的制备：采用如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示人工序列，经PCR扩增，取扩增产物中124bp的DNA片段作为sgRNA的DNA模板，所得的sgRNA的DNA模板经体外转录得sgRNA粗品。

可选的，所述系统还包括cas9 mRNA，其制备步骤为：采用含有人源化cas9 cDNA的PXT7质粒，经XbaI限制性内切酶作用，纯化得cas9mRNA的DNA模板，所得cas9mRNA的DNA模板经体外转录得cas9 mRNA粗品。

可选的，所述cas9mRNA的制备中：