[发明专利]一种利用蔗糖生物合成D-葡萄糖二酸的方法

说明书

一种利用蔗糖生物合成D‑葡萄糖二酸的方法旨在提高生物法合成D‑葡萄糖二酸的产量。在工程大肠杆菌中尝试将D‑葡萄糖高效转化为D‑葡萄糖二酸的路径探索耗费了很多年，在混糖发酵中合成D‑葡萄糖二酸的产量相比于单糖有所提高。我们在大肠杆菌BL21(DE3)中共表达cscB，cscA，cscK，(蔗糖途径)Ino1，MIOX，Udh，suhB(D‑葡萄糖二酸合成途径)7个基因，从功能上构建从蔗糖到D‑葡糖二酸的途径，该途径还未经报导。然后，进一步敲除zwf，pgi，ptsG，uxaC，gudD 5个基因，并且过表达基因Glk，以及构建D‑果糖依赖性的翻译控制系统，用于调控pgi基因的沉默或表达，与此同时使得蔗糖作为唯一碳源，从而获得更高的产量。

技术领域

本发明属大肠杆菌代谢工程领域，具体涉及了合成D-葡萄糖二酸的方法，尤其涉及以蔗糖为唯一碳源的，在大肠杆菌中合成D-葡萄糖二酸的方法和路径。

背景技术

随着气候的变化和化石资源的日益减少，人们普遍认为，在未来，生物炼制将替代石油冶炼来生产化学品和化学材料。D-葡萄糖二酸是一种可以进一步转化为其他增值商品的大宗化学品，包括洗涤剂助剂，腐蚀抑制剂，己二酸，酯和聚酰胺衍生物，因此它被美国能源部(DOE)作为2004年前十二种平台化学品之一。目前，大部分是用硝酸作为溶剂和氧化剂化学氧化D-葡萄糖来合成D-葡萄糖二酸。但是，化学氧化法存在的很多缺陷，成本过于昂贵并且污染环境。相反，使用微生物发酵来生产D-葡糖二酸，成本更低且更环保

D-葡萄糖二酸天然存在于水果，蔬菜和哺乳动物中，但是依靠大肠杆菌代谢工程和合成生物学能实现从D-葡萄糖微生物发酵来合成D-葡萄糖二酸。通过异源酶共表达得到D-葡萄糖二酸。

然而，当使用D-葡萄糖作为唯一碳源时，D-葡萄糖二酸在大肠杆菌中的产量比较低，因为部分D-葡萄糖被用于产生细胞生物量。先前的报道表明，可使用替代碳源(木糖，阿拉伯糖和甘油)进行细胞生长，同时D-葡萄糖作为碳源生产D-葡萄糖二酸。尽管底物转化效率优异，但混合糖发酵需要比单独的D-葡萄糖发酵具备更复杂的工业设计和工艺控制。根据上面表述，我们发现利用蔗糖(葡萄糖和果糖组成的最丰富的天然二糖)作为D-葡萄糖二酸生产的底物和碳源可以完全解决这些问题。与其他糖相比，蔗糖被认为是比D-葡萄糖更具有经济和环境优势。而且，细胞中由蔗糖水解的D-葡萄糖和D-果糖可分别用于D-葡糖二酸形成和细胞生长，而不添加额外的碳源。然而，基于蔗糖的大肠杆菌发酵受到挑战，因为大多数目前的工业大肠杆菌菌株不能利用蔗糖。

发明内容

本发明诣在提高在代谢工程大肠杆菌中D-葡萄糖二酸的产量，并且利用外源调控开关，使得细胞调控自身代谢平衡，在利用D-果糖供给自身生长的同时，让D-葡萄糖代谢合成D-葡萄糖二酸。

为了实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

在代谢工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)中利用蔗糖合成D-葡萄糖二酸。首先构建表达所需要的7个基因，然后，将上述所描述基因依次按顺序敲除，确保来自蔗糖的大部分的D-葡萄糖用于合成D-葡糖二酸，而D-果糖的水解产物消耗并且支持细胞生长。还优化了D-葡萄糖磷酸化途径即过表达Glk。更重要的是，为了进一步D-葡萄糖二酸的产量，构建的果糖敏感型开关可以当D-果糖用尽时，利用外源调控开关来平衡糖代谢。

1.一种利用蔗糖生物合成D-葡萄糖二酸的方法，其特征在于：构建了大肠杆菌的蔗糖利用途径，并且另外过表达了基因Ino1，MIOX，Udh和suhB，提高了大肠杆菌合成D-葡萄糖二酸的产量，并且，在敲除糖酵解和磷酸戊糖途径的基础上，敲除ptsG基因来消除ccr效应，添加Glk基因来消除由于敲除ptsG后D-葡萄糖磷酸化的速度的影响，之后又敲除了副产物基因uxaC,gudD基因来进一步提高D-葡萄糖二酸的产量。并且构建了对D-果糖敏感的控制pgi基因沉默或表达的逻辑开关，当D-果糖耗尽时，开关自动打开，使得葡萄糖-6-磷酸进入糖酵解途径，继续支持细胞的生长。

2.进一步，所述的利用蔗糖生物合成D-葡萄糖二酸的方法，包括以下步骤：