[发明专利]用于富集脊椎动物病毒核酸的方法

说明书

本发明提供一种用于富集脊椎动物病毒核酸的方法，所述方法包括根据所述脊椎动物病毒系统进化基因蛋白进行保守氨基酸分析而获得同源氨基酸序列组，然后获得的对应兼并核酸短序列组，通过扩增富集病毒序列方法来特异地富集样本中病毒核酸。本发明方法可以特异地富集样本中病毒DNA/RNA，达到对样本中的病毒DNA/RNA特异富集效果，可以有效提高感染样本中病毒DNA/RNA与宿主DNA/RNA的比例，提高后续高通量测序中病毒序列的比例并提高检测病毒的灵敏度。

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，特别涉及一种用于富集脊椎动物病毒核酸的方法。

背景技术

在病毒感染样本中，由于待检样本中除病毒核酸本身外，还通常含有大量的宿主基因组或转录组成分，这些成分极大的干扰了病毒核酸的有效检测，加上病毒核酸通常占比不高，导致病毒核酸更难被检测到，例如，在荧光PCR中，低拷贝数的总DNA/RNA样本会产生漏检情况；在宏转录组和宏基因组测序中，一些样本中宿主的数据量可占总数据量的99％以上，而病毒DNA/RNA分子的数据量不到1％。病毒含量过低，从宏转录组或宏基因组测序大数据中筛选到相关病毒DNA/RNA分子十分困难，需要巨大的数据量来支撑，大大提高了测序成本以及分析难度。面对这种情况，靶向富集我们想研究的脊椎动物病毒DNA/RNA分子，将能有效增加病毒核酸成份和数据量，提高后续检测的成功率、效率。

目前，对于感染样本中病毒DNA/RNA样本的富集技术主要是宿主基因组或转录组成份的去除。例如利用人核糖体序列探针杂交法去除感染样本中人核糖体转录组成份的去除，但这种方法富集效果通常不高，只能达到一倍以下的效果，同时由于存在非特异杂交，低拷贝的病毒核酸还可能经过富集后丢失。其次是利用随机的扩增的方法对微量样本核酸的非靶向富集。如序列不依赖的单引物扩增法(Sequence Independent Single PrimerAmplification，SISPA)，它虽然对微量感染样本中包括宿主基因组和病毒基因组进行随机扩增放大，但并不能有效富集病毒基因组(病毒DNA/RNA)。因此，需要一种针对病毒DNA/RNA的富集方法，对现有的富集病毒的技术方法进行范围的补充、技术的优化和改进，以实现高效、经济地提高感染样本中病毒基因组的比例，改善后续检测例如核酸扩增、转录组测序、宏基因组测序等的效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于富集脊椎动物病毒DNA/RNA的方法，该方法能够对样本中的病毒DNA/RNA特异富集效果，可以有效提高感染样本中病毒DNA/RNA的含量，在后续高通量测序中提高病毒核酸数据比例。我们称这种方法为序列依赖的单引物扩增法(Sequence Dependent Single Primer Amplification，SDSPA)。

在一种实施方式中，提供一种用于富集脊椎动物病毒核酸的方法，所述方法包括根据所述脊椎动物病毒系统进化基因蛋白进行保守氨基酸分析而获得同源氨基酸序列组，然后获得的对应兼并核酸短序列组，通过扩增富集病毒序列方法来特异地富集样本中病毒核酸。

在一种实施方式中，所述同源氨基酸序列组的氨基酸数量为2-10个，优选为5-7个。

在一种实施方式中，当是DNA病毒时，选择病毒系统进化基因蛋白是依赖DNA的RNA聚合酶(DDRP)、核蛋白或衣壳蛋白基因；和当是RNA病毒时，选择病毒系统进化基因蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)、核蛋白(NP)或衣壳蛋白(CP)。

在一种实施方式中，所述扩增富集病毒序列方法是不对称扩增富集病毒序列方法。

在一种实施方式中，所述不对称扩增富集病毒序列方法包括以下步骤：

步骤a:设计所述兼并核酸短序列组的兼并引物组；

步骤b:利用带第一标签序列的兼并引物组对提取的病毒总RNA反转录得到带第一标签的cDNA或对病毒dsDNA/ssDNA进行单链延伸反应得到带第一标签的ssDNA；