[发明专利]一种基于T7表达系统的表达组件

说明书

本发明公开了属于基因工程技术领域的一种具有稳定性、可调节性和通用性的反馈回路控制的基于T7表达系统的表达组件，该表达组件包含T7 RNA聚合酶基因、T7启动子、T7 RNAP转录调控元件和T7 RNAP翻译调控元件，适用于在DE3溶源化菌株以外的宿主中表达外源基因。本发明通过优化反义RNA基因和lac启动子基因实现了该表达组件的稳定传代；通过对T7 RNAP上游的核糖体结合位点RBS序列改变，构建了一系列不同强度的基于T7表达系统的表达组件；所构建的表达组件能够在多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中有效表达，且均能大量表达外源蛋白。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种具有稳定性、可调节性和通用性的基于T7表达系统的表达组件及其转化体，适用于在DE3溶源化菌株以外的宿主中表达外源基因。

背景技术

T7表达系统由T7噬菌体基因组上的启动子，以及能特异性识别该启动子的T7RNA聚合酶(简称T7RNAP)构成。该系统可以高特异性，高效率地转录T7启动子后面的DNA序列，同时被一种T7噬菌体基因组上的终止子T7Φ特异性终止，因而被广泛地应用于原核生物中外源基因的表达。

其中T7RNA聚合酶是在T7噬菌体(EnterobacteriaphageT7)中被发现，T7噬菌体是一种能侵染大肠杆菌(Escherichia coli,简称E.coli)的烈性噬菌体，其遗传物质为双链的线性DNA，长度约为39.94kbp。T7噬菌体基因组上的基因1(Gene1)长2652bp，由大肠杆菌启动子启动转录，并能被翻译得到一个含有883个氨基酸残基、分子量约为98kDa的蛋白质，即T7RNA聚合酶。该RNA聚合酶不能识别大肠杆菌中原有的启动子，只能识别T7噬菌体基因组上特异性的启动子，即T7启动子，并依据DNA模板合成RNA。

在T7表达系统被发现后，其高效性和特异性引起了人们的兴趣。而现有的T7表达系统依赖DE3溶源菌等特殊菌株或病毒载体，使用起来很不方便。

于是有研究者开始着手克隆、表达编码T7RNA聚合酶的基因，但这项工作遇到了很大的障碍。1980年代的研究者缺乏像今天一样成熟的PCR技术，只能选择从T7噬菌体的基因组上用限制性内切酶切下Gene1。在T7噬菌体的基因组上，Gene1后面紧接着两个T7启动子，而在这些启动子前没有可用的限制性位点将它们与Gene1分开。这种带有Gene1和T7启动子的限制性片段无法被成功地连接到质粒载体上并转化宿主。当时的研究者分析，造成这种情况的原因，是Gene1编码的T7RNA聚合酶与T7启动子之间产生正反馈作用，造成质粒DNA过量转录，进而耗尽细胞内的资源，使宿主细胞无法继续生长。注意到这种限制性片段上，Gene1的方向与T7启动子相同。当Gene1被转录并翻译得到T7RNA聚合酶后，聚合酶识别T7启动子并开始转录。由于该系统的转录效率很高，转录可能产生绕整个质粒、包含Gene1的mRNA，这些mRNA翻译将得到更多的T7RNA聚合酶。这样，便形成了T7RNA聚合酶与mRNA产生的正反馈循环，宿主细胞则因为资源在这个过程中被耗尽而无法生长。为了得到Gene1的完整序列而不引入后面的T7启动子，研究者在T7噬菌体的基因组上进行了一系列的突变，设法删去了含有T7启动子部分，并引入了新的限制性位点。这种方法最终使人们得到了包含Gene1完整序列的质粒，并成功表达出了有活性的重组T7RNA聚合酶。

此后，研究者尝试向带有Gene1的质粒上插入一段由T7启动子控制的基因。尽管质粒上Gene1受到乳糖操纵子lacO基因的控制，这一尝试仍以失败告终。可能的原因是，即使在非诱导条件下，lacO基因并不能完全被LacI蛋白阻遏，因而下游的Gene1有少量的表达。这种本底表达产生的少量T7RNA聚合酶依然导致了T7启动子下游序列的过量转录。