[发明专利]一种基因检测探针及基因检测方法

权利要求书

1.一种基因检测探针，其特征在于，包括含有检测目标基因的cDNA探针，其具有特定标记。

2.根据权利要求1所述的一种基因检测探针，其特征在于，其制备方法如下：首先从目标细胞、组织中分离纯化相应的mRNA，之后在逆转录酶的作用下，合成与之互补的DNA即cDNA，之后添加特定标记。

3.根据权利要求2所述的一种基因检测探针，其特征在于：目标细胞、组织为造血细胞，相应的mRNA为α或β珠蛋白mRNA。

4.根据权利要求2所述的一种基因检测探针，其特征在于：添加特定标记的方法如下，首先用适当浓度的DNAseⅠ在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNa poly merasⅠ的5’→3’的外切酶活性，切去带有5’磷酸的核苷酸；同时又利用该酶的5’→3’聚酶活性，使32P标记的互补核苷酸补入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的这两种活性的交替作用，使缺口不断向3’的方向移动，同时DNA链上的核苷酸不断为32P标记的核苷酸所取代。

5.根据权利要求2所述的一种基因检测探针，其特征在于：添加特定标记的方法为，使用T4RNA连接酶,将生物素标记在RNA的3’端，Laeger等通过缺口翻译法，在酶作用下标上生物素，使用含有生物素基的UTP类似物，在酶促反应下，将生物素掺入DNA。

6.根据权利要求2所述的一种基因检测探针，其特征在于：添加特定标记的方法为，用高碘酸盐氧化的化学途径，将生物素连接到RNA的3’端，或用戊二醛使生物素标记的组的蛋白H，与单链的核交联上。

7.根据权利要求1所述的一种利用基因检测探针的基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、收集目标细胞、组织活体1-1.5g，用7-9mL用7-9mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，离心后收集上清液，提取样本RNA；

S2、构建PCR反应体系，包括提取的样本RNA 1ul，上下游引物和探针混合液2-3.5ul，PCR酶混合液0.3-0.8ul，MasterMix 3-6ul，进行PCR扩增；

S3、进行琼脂糖凝胶电泳并送交测序。

8.根据权利要求6所述的一种利用基因检测探针的基因检测方法，其特征在于，PCR扩增的反应条件如下，85-92℃预变性10min，然后进入如下循环：85-92℃变性45s、48-52℃退火45s、70-75℃延伸55s，共32个循环，循环结束后于72℃延伸8min，3℃保存。

9.根据权利要求6所述的一种利用基因检测探针的基因检测方法，其特征在于，S3中电泳条件为：2%琼脂糖凝胶，100V电压，时间35min。