[发明专利]一种pnCasSA-BEC质粒及其应用

说明书

本发明提供了一种pnCasSA‑BEC质粒及其应用。所述的pnCasSA‑BEC质粒，其序列为SEQ ID NO：1。本发明能够的质粒(1)能够在各种金黄色葡萄球菌菌株中高效快速地进行碱基编辑，其中包括碱基突变和基因失活；(2)能够通过DNA复制机制实现碱基编辑而不会损失转化CFU，获得极高的转化效率。所述技术在金黄色葡萄球菌感染治疗、药物靶标发现、药物开发、金黄色葡萄球菌生理研究等方面具有广阔地应用前景。

技术领域

本发明涉及一种pnCasSA-BEC质粒及其应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种重要的人类病原体细菌，可以引发各种各样的感染疾病，既能引起轻微的皮肤感染，也能造成危及生命的重大感染，例如毒素休克综合症、坏死性肺炎、心内膜炎等。金黄色葡萄球菌具有超强的感染力主要归因于其精致的毒力调控系统、分泌的多种多样的细胞毒素以及多功能的细胞表面蛋白，如聚集因子、纤粘蛋白结合蛋白、胶原蛋白结合蛋白等。这些表面蛋白通过与人体细胞直接作用，能够使金黄色葡萄球菌逃避宿主免疫反应、促进其生物膜的形成和细菌定植等，为其生长创造一系列有利条件。近年来，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐万古霉素金黄色葡萄球菌（VRSA）的爆发给治疗金黄色葡萄球菌感染带来极大挑战。因此，迫切需要开发针对耐药性金黄色葡萄球菌的新型治疗手段。

高效基因组编辑技术对研究基因功能、发现新型药物靶标以及开发新型治疗手段具有重大意义。传统的在金黄色葡萄球菌中的基因组编辑技术主要是通过分步的双交换过程实现。此类方法步骤繁琐，费时费力。近期开发的金黄色葡萄球菌中的CRISPR/Cas9基因组编辑技术（pCasSA）一步实现基因组编辑，大大缩减了金黄色葡萄球菌中的编辑步骤。然而，此技术仍旧需要利用同源修复模板并且会大大降低编辑后细菌成活率，因而限制了其在许多转化效率低下的临床菌株中的应用。

近期，“碱基编辑器”的发明为金黄色葡萄球菌中的基因编辑提供了新的途径。它能够通过催化反应，直接实现基因组上的碱基变换。到目前为止，人们已经发明了两种碱基编辑器（胞嘧啶编辑器和腺嘌呤编辑器），它们分别由失活的Cas9（Cas9D10A，H840A）蛋白或Cas9 nickase（Cas9D10A）和脱氨基酶组成。胞嘧啶脱氨酶可通过Cas9 / sgRNA复合物导向基因组的任何位点，在Cas9 nickase / sgRNA结合后产生的单链DNA中，将胞嘧啶转化成尿嘧啶以实现碱基编辑。CRISPR / Cas9基因组编辑方法依赖于同源重组修复机制（在细菌中），并且需要供体修复模板。相比于产生双链断裂的CRISPR / Cas9基因组编辑方法，碱基编辑器通过脱氨基反应直接催化胞嘧啶转化成尿嘧啶，同时切割未编辑的链，并使用DNA复制机制实现胞嘧啶到胸腺嘧啶的转化。此类方法由于不涉及基因组双链断裂，因而不会损失转化CFU。

以下项目得到国家自然科学基金，项目编号：91753127；项目名称：细菌细胞壁回收调控机制以及生物学功能探究；国家自然科学基金，项目编号：31700123；项目名称：利用CRISPR/Cas9筛选金黄色葡萄球菌中影响生物膜形成的细胞壁表面蛋白；上海市科委，项目编号：17ZR1449200；项目名称：基于新型基因组编辑技术CRISPR/Cas9的高效天然产物合成基因簇的抓取技术开发；以及科技部重点研发计划，项目编号：2017YFA0506800；项目名称：信使RNA 腺嘌呤m6A 甲基转移酶复合机器的工作机理的资助。

发明内容

本发明的目的是提供一种pnCasSA-BEC质粒及其应用。

为了达到上述目的，本发明提供了一种pnCasSA-BEC质粒，其特征在于，其序列为SEQ ID NO：1。

本发明还提供了一种pnCasSA-BEC质粒，其特征在于，含有APOBEC1蛋白和Cas9nickase蛋白基因表达的启动子、APOBEC1蛋白基因片段、APOBEC1蛋白基因和Cas9 nickase蛋白基因的连接区域以及Cas9 nickase蛋白基因片段。