[发明专利]一种大肠杆菌冷休克助溶型表达质粒的构建方法及其应用有效
| 申请号： | 201810163346.1 | 申请日： | 2018-02-27 |
| 公开（公告）号： | CN108504670B | 公开（公告）日： | 2022-01-04 |
| 发明（设计）人： | 庞一林;谭国强;吕建新;李江辉;杜璟;张涛;孙倩倩;韩琴霞 | 申请（专利权）人： | 温州医科大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N9/50;C12N15/54;C12N9/10 |
| 代理公司： | 温州匠心专利代理事务所(特殊普通合伙) 33279 | 代理人： | 胡仁勇 |
| 地址： | 325000 浙江省温州市瓯海*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 大肠杆菌 休克 助溶型 表达 质粒 构建 方法 及其 应用 | ||
【权利要求书】：
1.一种外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特征在于：采用交叉PCR技术，将大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶 IscS 蛋白的 N 端第1-263 位氨基酸的核酸编码序列与人源半胱氨酸脱硫酶 NFS1蛋白C端第316-457位氨基酸的核酸编码序列进行融合，构建得到序列如SEQ ID NO.25所示的嵌合型半胱氨酸脱硫酶表达基因；将所述嵌合型半胱氨酸脱硫酶表达基因通过无缝克隆技术连接到pCold-SUMOa质粒获得重组质粒并进行表达；所述pCold-SUMOa质粒的构建方法如下：以pE-SUMOpro Kan质粒为模板，采用序列如SEQ ID N0.3所示的引物SUMO-F和序列如SEQ ID N0.4所示的引物SUMO-R扩增获得序列如SEQ ID N0.19所示Smt3融合蛋白序列，同时以经Sal I单酶切后的pCold TF质粒为模板，采用序列如SEQ IDN0.1所示的引物pCold-F和序列如SEQ ID N0.2所示的pCold-R扩增获得pCold质粒骨架片段，然后采用无缝克隆技术将上述两个片段连接获得重组质粒，命名为pCold-SUMOa。
2.根据权利要求1所述方法构建的嵌合型半胱氨酸脱硫酶，其特征在于：嵌合型半胱氨酸脱硫酶的稳定性高于人源半胱氨酸脱硫酶，其活性略低于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶。
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