[发明专利]蔗糖致死基因SacB在基因缺失反向筛选标记中的应用及其无痕缺失自杀载体

说明书

本发明涉及一种蔗糖致死基因SacB在基因缺失反向筛选标记中的应用及其无痕缺失自杀载体，本发明利用sacB基因编码蔗糖果聚糖酶，该酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并且将果糖聚合成高分子量的果聚糖，但高分子量果聚糖积累对细胞存在潜在的毒性作用，可造成细胞死亡。因此利用蔗糖致死基因SacB构建自杀载体，无需通过抗性基因来代替目的基因，避免了抗性标记对下游基因产生任何可能的极性作用，对鸭疫里默氏杆菌基因的功能研究具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及蔗糖致死基因SacB在基因缺失反向筛选标记中的应用，还涉及含有蔗糖致死基因SacB的无痕缺失自杀载体。

背景技术

基因敲除是研究细菌基因功能的一种重要方法，包括对鸭疫里默氏杆菌基因功能的研究。而基因敲除的方法主要包括由抗性基因介导的有痕缺失，以及由反向筛选基因介导的无痕缺失。目前用于鸭疫里默氏杆菌基因缺失的方法主要是有痕缺失，而有痕缺失会在基因组中留下抗性“疤痕”并导致下游基因的不转录，即“极性效应”。另外，由于鸭疫里默氏杆菌具有多重耐药性，所以用于鸭疫里默氏杆菌有痕缺失的抗性基因的选择范围有限。第三，为防止抗性基因扩散，制备鸭疫里默氏杆菌基因缺失疫苗需要无痕缺失的方法。在此背景下，急需一种无痕缺失的方法来对鸭疫里默氏杆菌基因功能进行研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种蔗糖致死基因SacB在作为基因缺失反向筛选标记中的应用；本发明的目的之二在于提供含有蔗糖致死基因SacB的无痕缺失自杀载体；本发明的目的之三在于提供所述无痕缺失自杀载体在鸭疫里默氏杆菌基因的无痕缺失中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.蔗糖致死基因SacB在作为基因缺失反向筛选标记中的应用。

2.含有蔗糖致死基因SacB的无痕缺失自杀载体，所述无痕缺失自杀载体由蔗糖致死基因 SacB克隆至穿梭质粒pLMF02的NcoI和XhoI酶切位点处，得质粒pLMF02::SacB，然后将复制起始位点pRA0726ori用oriT片段替换。

优选的，所述蔗糖致死基因SacB由以下方法制得，以质粒pEX18GM为模板，SEQ IDNO.1 和SEQ ID NO.2所示序列为引物进行PCR扩增而得。

优选的，所述PCR扩增的条件如下：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，循环30次；最后72℃后延伸7min，16℃保存。

优选的，所述oriT片段由以下方法制得：以pEX18GM为模板，以SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示序列为引物进行PCR扩增，得oriT片段。

优选的，所述自杀载体中oriT片段通过HindIII和PstI酶切位点替换质粒pLMF02::SacB的复制起始位点pRA0726ori。

3.所述无痕缺失自杀载体在鸭疫里默氏杆菌基因的无痕缺失中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明在于提供蔗糖致死基因SacB在作为基因缺失反向筛选标记中的应用，该方法能够简便高效进行基因的无痕缺失，可以用于鸭疫里默氏杆菌基因的功能研究；并且无需通过抗性基因来替代目的基因，避免了抗性标记对下游基因产生任何可能的极性作用；同时还具有生物普遍性，为研究其它细菌的无痕缺失提供了技术参考。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为SacB基因扩增电泳图(M为marker；1为SacB基因)。