[发明专利]成软骨培养基及其在ADSCs成软骨分化中的应用

说明书

本发明提供一种成软骨培养基及其在ADSCs成软骨分化中的应用。其包括以下成分，脂肪干细胞成软骨诱导分化基础培养基、地塞米松、抗坏血酸、ITS、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF‑β3。利用一般培养基培养脂肪干细胞成软骨分化(Safranin 0染色)需要28天，且细胞实验检测发现，有部分细胞分化成了骨细胞(ALP染色鉴定)，而采用本发明培养基成软骨分化只需21天，同时抑制了ADSCs向成骨分化方向进行。

技术领域

本发明涉及生物细胞学领域，尤其涉及成软骨培养基及其在在ADSCs成软骨分化中的应用。

背景技术

膝关节软骨组织容易因创伤、感染、骨关节炎或其它疾病等造成损伤，而膝关节软骨可为膝关节之间的骨组织提供支撑和保护作用，因此一旦受损必将影响患者运动。由于软骨组织再生和自我修复能力有限，导致了软骨损伤修复仍然是临床上的一大难题和挑战。组织工程软骨的产生为软骨损伤临床治疗提供了美好的前景，但如何让种子细胞成功的快速的分化成软骨组织而不是成骨分化是组织工程中最大难题。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明一方面提供了一种成软骨培养基，其特征在于，包括以下成分，脂肪干细胞成软骨诱导分化基础培养基、地塞米松、抗坏血酸、ITS、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β3。

本发明另一方面提供了上述的成软骨培养基在ADSCs成软骨分化中的应用，采用所述的成软骨培养基，在正常条件下诱导21天，每三天换一次液。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

利用一般培养基培养脂肪干细胞成软骨分化(Safranin O染色)需要28天，且细胞实验检测发现，有部分细胞分化成了骨细胞(ALP染色鉴定)，而采用本发明培养基成软骨分化只需21天，同时抑制了ADSCs向成骨分化方向进行。

附图说明：

图1为本发明实施例中的脂肪干细胞分离及鉴定图。

图2为本发明实施例中成骨与成软骨分化标记图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步地说明，以更好地理解本发明。

1、脂肪干细胞分离：

首先取新西兰大白兔腹股沟处的脂肪组织，放入含有青链霉素的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)中洗净血污。转入一个新的培养皿中，充分剪碎，加入消化液(10％胎牛血清，0.09％胶原酶I，其余为DMEM/F12)，移液器充分打匀，直到组织可以通畅的出入吸嘴，将脂肪组织转入离心管中，37℃消化1h，定时摇晃，使组织和消化液充分混匀。消化完后，反复吹打消化液，分散组织块，制成细胞悬液。1200rpm离心5min，将上层的脂肪组织反复吹打最少1min，再次离心。弃掉上层成熟的脂肪组织和中层的消化液，再用基础培养基重悬底层的细胞。先将细胞悬液用250μM的尼龙滤网过滤细胞悬液，再将所得滤液用孔径为80μM的尼龙过滤，除去大部分的成熟脂肪细胞，收集滤液，每次过滤后注意再用适量的基础培养基洗涤滤网，减少滤网上的细胞残留。将最后得到的滤液离心，吸弃漂浮的脂肪细胞，用基础培养基反复洗涤3遍。细胞培养，最后一次用完全培养基重悬，接种，置于培养箱中常规培养。首次换液，弃去培养基，PBS反复洗涤5-6次，加入新鲜的完全培养基继续培养。重复3次换液直到细胞面基本干净。消化并扩大培养鉴定。

利用常规免疫荧光方法及流式细胞仪技术检测ADSCs相对特异的分子CD29，CD44，CD90，CD105等。流式细胞仪技术检测细胞周期，计算处于G0/G1期的细胞比例。通过不同诱导液对体外培养的ADSCs进行诱导分化，使ADSCs向软骨细胞、脂肪细胞及内皮细胞方向分化，采用茜素红、ALP、油红、番红-O-染色及CD31等染色方法。